Diseño y optimización de medios de cultivo NUTRICIÓN MICROBIANA ALEJANDRA BOSCH

Optimización de la expresión celular Producción de algún producto Aumento de producción de biomasa Mejorar la velocidad o rendimiento de algún producto

Efectores que intervienen en el crecimiento y formación de productos Efectores intracelulares se refiere a la información genética que posee el microorganismo. La misma puede ser modificada por el agregado o extracción de genes. Efectores extracelulares son los factores del entorno que pueden modificar la expresión: físicos y químicos

Efectores extracelulares Fisicoquímicos son los relacionados con las características del sistema de cultivo agitación, aeración, formación de espuma, nutrientes del medio de cultivo, pH, presión osmótica, estado redox, los parámetros físicos como T y P.

Clasificación de medios Por naturaleza química de los componentes Medios sintéticos Medios sintéticos o medios químicamente definidos Medios complejos Medios complejos en cuya composición intervienen sustancias de origen animal o vegetal suero de leche, hidrolizados de proteínas como peptonas, extracto de levadura, macerado de maíz, harina de soja Químicamente indefinidos y de composición variable

Clasificación de medios Por los requerimientos nutricionales Medios mínimos Medios mínimos contienen unicamente los nutrientes esenciales para el crecimiento Medios ricos Medios ricos son suplementados con nutrientes que por lo general son intermediarios en la síntesis de componentes celulares: amino ácidos, vitaminas precursores de la síntesis de ácidos nucleicos. Aumentan la velocidad de crecimiento, Reducen la fase lag

Tipos de nutrientes Macronutrientes Macronutrientes [ g/l ] > M Tipo I: C H O N (10 -2 y M) Tipo II: S, P, K y Mg (10 -3 y M) Micronutrientes o elementos trazas Micronutrientes o elementos trazas [mg/l o µ g/l] Tipo III: Elementos trazas: (metálicos) Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co Tipo IV: Factores de crecimiento Componentes orgánicos que no son sintetizados ni metabolizados por las células vitaminas, aminoácidos ácidos grasos no sat.

Requerimientos nutricionales Macronutrientes Tipo I Fuentes C ( Fuentes C (Fuente de C y energía) Hidratos de Carbono (glucosa o dextrosa, sacarosa, lactosa) Lípidos hidrocarburos (alcanos: hexadecano, octadecano) Alcoholes (glicerol y manitol) Melaza Harina de arroz Almidón Suero de quesos

Requerimientos nutricionales Fuentes N El nitrógeno es utilizado para la biosíntesis de proteínas, ácidos nucleicos y polímeros de la pared celular. Puede ser de naturaleza inorgánica u orgánica NH4 (NH42SO4). Acidificación durante el crecimiento Urea, NO3, N2 Aminoácidos Aminoácidos dan mayores rendimientos Peptonas. Peptonas. Son hidrolizados parciales de proteínas ( H o OH) Carne, pescado, gelatina, caseína. Extracto de levadura, Extracto de levadura, en forma de pasta o polvo, y puede ser obtenida mediante autólisis de la levadura Extracto de malta, Extracto de malta, que es el extracto soluble en H2O de la malta de la cebada Cornsteep Cornsteep maceración de la industria del maíz

Requerimientos nutricionales Macronutrientes Tipo II PS P y el S son suministrados en forma de P04H y S04 (o aminoácidos azufrados) El P se incorpora en ácidos nucleicos, y polímeros celulares. El S es asimilado para la síntesis de aminoácidos azufrados, y además se necesita para la biotina y otros componentes.

Requerimientos nutricionales Macronutrientes Tipo II KMg K y el Mg son suministrados en forma de P04 y S04 (o aminoácidos azufrados) El K es un componente intracelular importante, principal catión inorgánico. El Mg asociado a la función ribosómica, cofactor de enzimas y componente de pared celular.

Requerimientos nutricionales Micronutrientes (Tipo III) Esenciales para el crecimiento Fe, Mn, y Zn Esenciales en condiciones particulares Co, Cu, Mo, Ca Raramente esenciales B, Na, Al, Si, Cl, V, Cr, Ni, As, Se generalmente están presente en suficiente cantidad como impureza de los componentes principales. Se agregan como sales solubles de Cl-, SO4=, NO3, MoO4

Requerimientos nutricionales Factores de crecimiento (Micronutrientes Tipo IV) Se agregan en el orden de a M Coenzimas: colina Acido oleico ( lactobacilos) Ácidos grasos Biotina Vitaminas B1,2,3,5,6 LOS MICROORGANISMOS NO CRECEN SIN ELLOS Aminoácidos Precursores de ácidos nucleicos u otros intermediarios INCREMENTAN LA VELOCIDAD DE CRECIMIENTO DISMINUYEN LA FASE LAG

Disponibilidad de los nutrientes disueltos disponibles Los nutrientes además de estar presentes en el medio de de cultivo, deben estar disueltos para estar disponibles para ser usados por la célula. ¿POR QUÉ PUEDEN NO ESTAR DISPONIBLES? la esterilización por calor. Se debe tener en cuenta la temperatura, tiempo de calentamiento, pH del medio reacciones entre componentes antes, durante o después de la esterilización

Disponibilidad de los nutrientes Los HPO4 utilizados como fuente de P y buffer deben esterilizarse separados de las sales de Mg, con Na, K y NH4 NaMgPO4 NH4MgPO4poseen baja solubilidad KMgPO4 Los PO4 deben esterilizarse separadamente de las sales de Mg y NH4 de las sales de Mg y NH4

Disponibilidad de los nutrientes azúcaresdescomponerse Los azúcares pueden descomponerse por la acción del calor en presencia de sales inorgánicas y compuestos amínicos. sales, H+ sacarosa hidroliza carbonilos de los azúcaresgrupos amino de las proteínas Los grupos carbonilos de los azúcares con los grupos amino de las proteínas, aminoácidos, etc., dan productos de condensación (reacción de Maillard), los cuales disminuyen significativamente las cantidades de carbohidratos y N amínico disponible. azúcares reductores + -NH2 condensación Los carbohidratos se deben esterilizar por separado de los compuestos nitrogenados orgánicos.

Disponibilidad de los nutrientes Aminoácido, Factores de crecimiento son lábiles al calor Vitaminas Se los prepara disolviéndolos separadamente en pequeños volúmenes de agua, en soluciones muy concentradas. Se los esteriliza por filtración. Se los incorpora a los medios de cultivo ya esterilizados (en general 1ml de solución por cada litro de medio) en condiciones de asepsia. Fuente de N sales de NH4+ Fuente de N utilizada son sales de NH4+ Esterilizar a un pH < 7 para evitar su volatilización como NH3. urea Si ésta es urea debe esterilizarse por filtración Al del calor se descompone en NH3 y CO2,

Disponibilidad de los nutrientes fracciones separadas Es aconsejable entonces, esterilizar los componentes de los medios de cultivo en fracciones separadas: Fracción 1 Fracción 1: Fte. de C, micronutrientes, sales de Mg, Ca, etc. Fracción 2: Fracción 2: Fte. de N en caso que se descomponga por calor (urea) debe esterilizarse por filtración, o en caso de que reaccione con la fuente de C puede esterilizarse por calor pero separadamente. Fracción 3: Fracción 3: Vitaminas y factores de crecimiento. Se preparan soluciones 1000 veces mas concentradas y se esterilizan por filtración. Fracción 4 Fracción 4: Fosfatos, se esterilizan por calor.

Diseño, Formulación, Optimización de medios de cultivo Diseño Diseño: Elección de los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formación de productos Formulación Formulación: Proporciones, concentraciones de cada componente. Optimización Optimización: Encontrar la mejor formulación para lograr el objetivo (máx biomasa, producto, etc.)

Optimización Para organismos aerobios generalmente se utiliza como sistema de cultivo erlenmeyers agitados Realizar experimentos, en los cuales se varía la concentración de 1 componente manteniendo constante las concentraciones de los demás ingredientes Se varían más de un componente empelando un diseño factorial Se analiza el efecto de la/ las variable escogida sobre la velocidad de crecimiento, rendimientos yxs, yps, etc.

Problelma C B E D A