QUÍMICA BIOLÓGICA Lic. Cs. BIOLÓGICAS Lic. Cs. BIOLÓGICAS Prof. en BIOLOGÍA Prof. en BIOLOGÍA Lic. BIOTECNOLOGÍA Lic. BIOTECNOLOGÍA 2016

PROGRAMA ANALITICO Y/O DE EXAMEN Bolilla 11 - Inmunoquímica - Aplicaciones LIC. Y PROF. CS BIOL – LIC. BIOTECNOLOGÍA QCA. BIOLÓGICA Inmunoquímica. El Sistema Inmunitario. Inmunidad Humoral: cinética de la respuesta inmune, estructura de las inmunoglobulinas, isotipos de las cadenas pesadas, inmunoglobulinas de membrana, naturaleza del antígeno (Ag). Haptenos. Anticuerpos monoclonales y policlonales. Reacción Ag-Ac. Afinidad de los anticuerpos. Termodinámica de la afinidad. Cinética de la reacción Ag-Ac. Afinidad y avidez: determinación. Especificidad del anticuerpo. Significado biológico de los anticuerpos de alta y baja afinidad. Técnicas inmunoquímicas. Técnicas de enzimo-inmunoensayo. Inmunoprecipitación e Immunoblotting. Técnicas de inmunofluorescencia. Aplicaciones. Producción de anticuerpos. Producción y Especificidad de antivenenos. Reconocimiento del veneno de animales ponzoñosos. Neutralización de la actividad letal del veneno, mezcla antisuero. Detección de pesticidas por técnicas inmunoquímicas. Otras.

TÉCNICAS INMUNOQUÍMICAS ¿Qué son? Aplicaciones analíticas de la reacción Ag-Ac Reacciones Inmunológicas Aplicaciones Métodos analíticos biológicos Herramientas para el análisis de sustancias de interés en Biología Animal y Vegetal difíciles de medir Propiedades aplicadas Especificidad de la unión Antígeno-Anticuerpo (Ag-Ac) Un Ac se une a un Ag determinado Capacidad de visualización de la unión Ag-Ac Cuantificación del Ag conociendo la cantidad de Ac (o viceversa)

ANTICUERPOS POLICLONALES El método usual para producir ANTICUERPOS POLICLONALES experimentalmente consiste en: La inoculación de animales de experimentación con preparaciones del Antígeno (inmunógeno) purificado total o parcialmente La administración de un inmunógeno in vivo estimula diferentes células del sistema inmune, dando origen a una población mixta de anticuerpos derivados de un número variado de clones de linfocitos B (policlonal) El suero de un animal inmunizado contiene estos anticuerpos y es referido como ANTISUERO POLICLONAL PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS en animales de experimentación Muchos Anticuerpos usados en Técnicas Inmoquímicas son producidos por inmunización repetida de un animal por ejemplo: conejo, cabra, oveja, gallina, ratón, cobayo;

En general, al preparar un protocolo de inmunización experimental se debe considerar un conjunto de factores que afectan el tipo y la magnitud de la respuesta humoral del animal inmunizado Estos factores son los siguientes:  especie del animal utilizado  constitución genética del animal  dosis del inmunógeno  ruta de administración del inmunógeno  número de inmunizaciones (refuerzos)  calidad, cantidad y pureza del inmunógeno PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS en animales de experimentación En el laboratorio se inmuniza frecuentemente : conejos son fáciles de mantener responden bien frente a un amplio rango de antígenos es posible obtener hasta 25 ml de suero de cada desangrado sin efectos dañinos para el animal

ANTISUERO POLICLONAL ANTICUERPOS MONOCLONALES específicos contra un único epítope derivados de la activación y proliferación de un solo clon de linfocitos B

Visualización de la unión Ag-Ac Principales métodos analíticos basados en la unión Ag-Ac TRAZADORTÉCNICA Complejo Ag-Ac Fluorocromo Aglutinado Radioisótopos INMUNOPRECIPITACIÓN (Inmunoelectroforesis, Técnica de Ouchterlony, etc.) INMUNOAGLUTINACIÓN (Hemoaglutinación, partículas de látex, etc.) INMUNOFLUORIMETRÍA (Directa, Indirecta, Citometría de Flujo) RADIOINMUNOENSAYOS (RIA) EnzimasENZIMO-INMUNOENSAYO (ELISA)

TÉCNICAS INMUNOQUÍMICAS Las principales técnicas aplicadas  1- TÉCNICAS DE INMUNOPRECIPITACIÓN 1.a)- Reacción de precipitación clásica El Ag y el Ac deben estar en solución Se emplea como ensayo cualitativo o semicuantitativo para medir la cantidad de Ac Cuando se agrega un Ag en solución a un Antisuero se forma un precipitado del complejo Ag-Ac El complejo Ag-Ac originan estructuras enrejadas tridimensionales Estas estructuras se contactan preferentemente por interacción de los fragmentos Fc-Fc de los Ac

El complejo Ag-Ac precipita espontáneamente o por centrifugación El complejo Ag-Ac precipita espontáneamente o por centrifugación cuando la proporción de Ag y Ac de la mezcla es equivalente -Cantidades crecientes de Ag se agregan a una concentración constante de Antisuero (Ac) -Cantidades crecientes de Ag se agregan a una concentración constante de Antisuero (Ac)

1.b)- Difusión radial doble – Técnica de Ouchterlony Inmunoprecipitación en medio sólido (agar): Suero (Ac) = muestra a investigar Línea de precipitación (zona de equivalencia)

 2- TÉCNICAS DE INMUNOAGLUTINACIÓN Cuando el Ag forma parte o se ha unido a la superficie de  glóbulos rojos  plaquetas  leucocitos  partículas de látex El complejo Ag-Ac se hace visible por la aglutinación que producen los Ac al reconocer los Ag en las superficies de células o partículas de gran tamaño Se utilizan para identificar bacterias, tipificar glóbulos rojos 2.a)- Aglutinación de partículas recubiertas por Ag Ej: Anticuerpo Antígeno de superficie Partícula de látex Ej: látex-IgG detecta factores reumatoideos

2.b)- Hemoaglutinación - Directa Ej: Determinación del grupo sanguíneo y factor Rh Detecta la presencia de Ag en la superficie de los glóbulos rojos Produce aglutinación cuando los glóbulos rojos posean la especificidad del Ac (antisuero) añadido Aglutinación Ac anti A, B ó AB

Utiliza fluorocromos o moléculas colorantes fluorescentes Cada fluorocromo absorbe luz en una longitud de onda de alta energía (long. onda corta) y la convierte en luz de menor energía (long. de onda más larga) Un fluorocromo tiene un espectro de excitación y otro de emisión característicos La molécula que fluoresce se puede fijar en el Ac preparado contra la proteína de interés La fluorescencia es detectada usando luz UV en un microscopio de fluorescencia La IF se utiliza en detección de Ac contra Ag de Células y tejidos Ej. de Fluorocromos: Fluoresceína, Rodamina, Texas Red  3- TÉCNICAS DE INMUNOFLUORESCENCIA (IF)

3.a)- Inmunofluorescencia Directa Usa un Ac marcado con el fluorocromo: Ac Primario (Ac 1°) El Ac marcado se une al Ag de membrana y se observa su fluorescencia al microscopio de luz UV Permite la detección del Ag de interés en un solo paso Limitación: hay que producir un Ac-marcado con fluorocromo para cada Ac necesario 3.b)- Inmunofluorescencia Indirecta Usa un Ac primario sin marcar que reacciona con el Ag de interés Luego, un Ac secundario (Ac 2°) marcado se une al Ac1° y puede ser detectado por fluorescencia IF Directa IF Indirecta

Las células en suspensión circulan como gotas microscópicas Las células pasan por un campo atravesado por un rayo laser El laser produce dispersión de la luz y activación de la fluorescencia Las células son separadas al ser cargadas eléctricamente, y por placas deflectoras El flurocromo se excita Permite conocer el % células reconocido por el Ac monoclonal usado Permite el estudio de poblaciones de células vivas (ej: sangre periférica) marcadas con un fluorocromo  3.c)- Citometría de Flujo Ejemplo: Análisis de una muestra de agua marina conteniendo fitoplancton fotosintético por medio de CITOMETRÍA DE FLUJO mostrando tres poblaciones diferentes (Prochlorococcus, Synechococcus, ypicoeucariotas)ProchlorococcusSynechococcuspicoeucariotas

Reoresentación de un citómetro de flujo y Separación celular  3.c)- Citometría de Flujo

 4- TÉCNICAS DE RADIOINMUNOANÁLISIS (RIA) Técnica que nace en los años – Utiliza Radioisótopos (Iodo125, Iodo132) – Esta es su principal desventaja. Es muy sensible, mide pequeñas cantidades de sangre. Cualquier sustancia del organismo puede ser considerada un antígeno. Los anticuerpos sirven para medir la cantidad de hormonas que hay en el organismo. Se aplica para medir: Hormonas peptídicas: T3, T4, TSH, GH. Casi todas las hormonas hipofisarias. Hormonas no peptídicas: Estrógenos, testosterona...Hormonas sexuales. Sustancias no hormonales que pueden considerarse como antígenos: Marcadores tumorales, medicamentos. Esquema del principio general de RIA para medir Hormonas

 5- TÉCNICAS DE ENZIMOINMUNOANÁLISIS (ELISA: Enzyme-Linked Inmunosorbent Assay, ensayo de enzima ligada ) El complejo Ag-Ac se hace visible por el uso de una Enzima que reacciona con su Sustrato en una reacción colorimétrica La Enzima se puede unir al Ag o al Ac y este se encuentra inmovilizado en la superficie de una fase sólida (pocillo de una placa de microtitulación) El complejo Ag-Ac formado en la fase sólida debe separarse (lavados) de los reactivos libres que están en solución y en exceso Esa separación debe realizarse antes de medir la señal colorimétrica  5.a)- ELISA No Competitivo (“sandwich”) Fig. A) Fig. A)- Usa 2 tipos de Ac, cada uno reconoce un Ag Un Ac está inmovilizado en la fase sólida El otro Ac está conjugado con una Enzima El analito queda atrapado entre los 2 Ac La cantidad de analito de interés es directamente proporcional a la Enzima medida 5.a)- ELISA Competitivo5.a)- ELISA Competitivo Figs. B, C y D) El analito (Ag ó Ac) compite con el Ag ó Ac respectivamente marcado con la Enzima

Técnica de la enzima Peroxidasa de rábano aplicada a tejidos Sustrato : H 2 O 2 Enzima : Peroxidasa

5.a)- ELISA Competitivo EJEMPLO Técnicas Inmunoquímicas para análisis de Residuos de Pesticidas Objetivo Objetivo: Detección y cuantificación de residuos de PESTICIDAS (Insecticidas, Herbicidas, Fungicidas) en muestras biológicas (alimentos), y en el ambiente (agua, suelos) Obstáculo Obstáculo:PESTICIDAS Moléculas pequeñas de bajo peso molecular HAPTENOS No son inmunogénicas = HAPTENOS Sólo provocan respuesta inmune si se acoplan a una macromolécula (Proteínas: ovoalbúmina, albúmina sérica bovina, fibrinógeno) No presentan grupos funcionales que posibiliten la conjugación con la proteína Se le incorporan grupos funcionales: -NH 2, -COOH, -OH, -SH Hapteno Esto se conoce como sintetizar el Hapteno (mimético del pesticida en estudio)

Repasemos… ( Albúmina de suero bovino)

5.a)- ELISA Competitivo5.a)- ELISA CompetitivoEJEMPLO Técnicas Inmunoquímicas para análisis deTécnicas Inmunoquímicas para análisis de Residuos de Pesticidas Etapas para el análisis de un Pesticida I)-Conocer el diseño del Hapteno (molécula de bajo PM, no inmunogénica) II)-Síntesis del Hapteno III)-Conjugación de una proteína (complejo inmunogénico) IV)-Inmunización adecuada del huésped (conejo) V)-Análisis de los Ac en el suero sanguíneo, a lo largo del tiempo (Ag-Ac) Pesticida = Hapteno

5.a)- ELISA Competitivo5.a)- ELISA CompetitivoEJEMPLO Técnicas inmunoquímicas para análisis deTécnicas inmunoquímicas para análisis de Residuos de Pesticidas Ventajas  Rápido  Sensible  Se realiza in situ  Muchas muestras diarias

5.a)- ELISA Competitivo5.a)- ELISA CompetitivoEJEMPLO Técnicas inmunoquímicas para análisis deTécnicas inmunoquímicas para análisis de Residuos de Pesticidas Equipos de Inmunoensayos comerciales (kits de análisis) La mayoría aplican la técnica ELISA Competitivo

 6- TÉCNICAS DE INMUNOANÁLISISCROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD Separación de Proteínas en una columna cargada de polímero El polímero contiene el Ac específico contra la proteína de interés Las proteínas no deseadas se lavan La proteína de interés se libera de la columna con exceso de Ac en solución Proteína = Ag Ligando = Ac

Método: Western Blotting = Inmunoblotting (Towbin et al. 1979)  Se basa en la unión específica de Ac a Proteínas (Ag) inmovilizadas sobre una membrana  Permite detectar el Ac unido y con eso la Proteína, con uno de numerosos métodos de detección  Permite identificar la proteína de interés dentro de una mezcla y conocer datos cualitativos y semicuantitativos sobre la misma  “Blotting” significa “transferencia” de macromoléculas biológicas de un gel a una membranaEtapas: 1- Separación de las macromoléculas (proteínas) mediante Electroforesis en gel, según su PM 2- Transferencia (blotting) de las macromoléculas a una membrana de nitrocelulosa 3- Bloqueo de la membrana para evitar la unión inespecífica a su superficie de los Ac que se usarán para detectar la proteína de interés 4- Unión a la proteína transferida de un Ac específico marcado con una Enzima (Reacción Ag-Ac) 5- Detección con un Sustrato apropiado para esa Enzima formando un Producto detectable: precipitado cromogénico o fluorogénico, sustrato quimioluminiscente que al reaccionar con la Enzima da un Producto luminoso 6- Detección del producto final luminoso mediante una película fotográfica o una cámara (revelado). 7- Cuantificación de la señal - La intensidad de la señal, cualquiera sea el S utilizado, es directamente proporcional a la cantidad de Ag en la superficie de la membrana

Western Blotting-Etapa 1- ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA Objetivo: separación de proteínas de una mezcla

Western Blotting-Etapa 1 ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA Separación de la mezcla de Proteínas

ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA Separación de la mezcla de Proteínas Western Blotting-Etapa 1

-Etapa 2 - Transferencia (blotting) de las macromoléculas a una membrana de nitrocelulosa

Western Blotting-Etapa 2 -Transferencia (blotting) de las macromoléculas a una membrana de nitrocelulosa

Western Blotting-Etapas

Aplicación del WESTERN BLOT –Venenos de alacrán

Obtención de anticuerpos anti-venenos

VENENOS DE SERPIENTES DE ARGENTINA

!!MUCHAS GRACIAS POR ESTAR EN QUIMICA BIOLOGICA!! EN QUIMICA BIOLOGICA!!2016