Análisis Citométrico de la Función Plaquetaria: Técnicas de Análisis

ESTUDIO CLINICO DE LA HEMOSTASIA: INTEGRACION DE FUNCION PLAQUETARIA Y COAGULACION El estado actual del conocimiento de la hemostasia, su regulación y su patología exige incluir el análisis de la función plaquetaria en el estudio de los fenómenos prohemorrágicos y protrombóticos. El desarrollo actual de la citometría de flujo la convierte en una tecnología de elección para ese fin. La disponiblidad de técnicas citométricas en sangre entera potencia el valor diagnóstico y pronóstico de la citometría de flujo en el estudio clínico de la hemostasia.

LA PREGUNTA CLAVE: ¿HAY VIDA MAS ALLA DE ESTE HISTOGRAMA?

LA RESPUESTA: HAY VIDA (SIN NUCLEO) MAS ALLA DE ESTE HISTOGRAMA!!!

Los citómetros de flujo son para analizar leucocitos. LAS DIEZ MEJORES “EXCUSAS” PARA NO ESTUDIAR LA FUNCION PLAQUETARIA POR CITOMETRIA DE FLUJO Los citómetros de flujo son para analizar leucocitos. Las plaquetas son demasiado pequeñas para ser detectadas. Las plaquetas sólo se pueden estudiar en forma de PRP. Las plaquetas se activan con mucha facilidad. No hay marcadores fenotípicos de plaquetas. Hay demasiados marcadores fenotípicos de plaquetas. Pero si en la Hemostasia lo importante es la coagulación... Pero si ya se usa un contador de plaquetas... Pero si ya se usa el agregómetro... Pero si ya las estudian en el Centro de Transfusiones...

ESTUDIO COMPLETO DE LA HEMOSTASIA: VENTAJAS DE LA CITOMETRIA EN SANGRE ENTERA Permite estudiar la función plaquetaria en condiciones cuasi-fisiológicas La manipulación mínima previene la activación artefactual de plaquetas Evita la pérdida potencial de subpoblaciones plaquetarias Requiere pequeños volúmenes de muestra (pocos microlitros de sangre) Permite el análisis simultáneo de plaquetas y otras células sanguíneas

ESTUDIO COMPLETO DE LA HEMOSTASIA: VENTAJAS DE LA CITOMETRIA EN SANGRE ENTERA +ADP BASAL

ESTUDIO COMPLETO DE LA HEMOSTASIA: CITOMETRIA FUNCIONAL VERSUS AGREGOMETRIA ADP FS Log SS Log

CITOMETRIA DE FLUJO EN EL ANALISIS DE PLAQUETAS Hasta ahora, el análisis citométrico de plaquetas más habitual es el de anticuerpos antiplaquetarios: Autoanticuerpos Aloanticuerpos: Inmunofenotipo de HPA-1a Detección de anticuerpos maternos y fetales anti-HPA-1a Analisis de IgG asociadas a plaquetas en trombopenias Analisis de IgG asociadas a plaquetas en aloinmunización Cross-match de plaquetas

CITOMETRIA DE FLUJO EN EL ANALISIS DE PLAQUETAS La función plaquetaria también se puede analizar ampliamente en sangre entera por citometría de flujo Activación plaquetaria in vivo Reactividad plaquetaria in vitro Interacciones plaqueta-plaqueta Interacciones plaquetas-leucocito Interacciones plaquetas-eritrocito Liberación de micropartículas procoagulantes Alteraciones en el recuento de plaquetas Alteraciones en la morfología de la plaqueta Maduración normal y patológica de la plaqueta Monitorización del tratamiento antiagregante

ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA ANALISIS DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA

ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA La preparación y el procesamiento de la muestra deben ser cuidadosos para mantener las funciones intrínsecas Las condiciones del análisis citométrico se deben adaptar para acotar la población de plaquetas RBC Plaquetas

ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA La extracción debe realizarse en reposo y con el mínimo traumatismo Se recomienda desechar los primeros mL de muestra La sangre entera se debe anticoagular con citrato Las muestras se diluyen (1:100) para minimizar la formación de agregados plaquetarios Se utiliza un anticuerpo monoclonal contra una proteína constitutiva de la superficie de la plaqueta para identificar y seleccionar la población plaquetaria

ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA Preparar todos los reactivos necesarios anticipadamente Dispensar la sangre sobre anticoagulante Diluir la sangre (antes de 30 min) con el tampón adecuado Opciones de ensayo: Fijar  Marcar Activar  Fijar  Marcar Activar  Marcar  Fijar Marcar  Activar  Fijar Marcar y activar simultáneamente  Fijar Diluir en tampón adecuado o fijador Analizar p0or citometría de flujo

ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA Muestras fijadas Ventajas: Fácil de realizar antes de 30 minutos de la toma de muestra Mejor estimación estática del estado de activación plaquetario Desventajas: Impide estudiar las respuestas de activación plaquetaria Algunos epitopos se pueden alterar por el fijador Muestras frescas Ventajas: Posibilidad de medir la activación plaquetaria in vivo y la reactividad plaquetaria a varios agonistas Desventajas: La preparación es crítica debido a la activación espontánea de las plaquetas con el tiempo

ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA En ausencia de agonistas exógenos se determina el estado de activación in vivo de las plaquetas circulantes La adición de un agonista permite analizar la reactividad in vitro de las plaquetas circulantes. BASAL +ADP

ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA Los agonistas más utilizados para la estimulación de plaquetas son: Agonistas fuertes: Trombina y TRAP Agonistas débiles: ADP, Colágeno, Tromboxano A2 Ionóforos de Calcio: Ionomicina, A23187 Esteres de forbol: PMA

ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA BASAL COLLAGEN ADP THROMBIN

Ca2+ en sangre = 10.000 en citosol STD Plaqueta en reposo gránulos densos [ Ca2+ = 100 nM [ mitocondrias gránulos a Ca2+ GPIIb/IIIa Plaqueta activada Canales específicos Ca2+ Ca2+ STD GD

ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA La respuesta plaquetaria se puede estimar con: Anticuerpos monoclonales contra marcadores de activación Fluorocromos específicos de funciones bioquímicas Parámetros morfológicos asociados a cambios funcionales Contaje CD62P

PARAMETROS CITOMETRICOS DE ACTIVACION PLAQUETARIA Marcador Citométrico Emisión de Fluorescencia Parámetro Cambio detectado 2+ Ca libre citosólico Aumento reversible FLUO-3 AM Aumento reversible Actina G Polimerización a Actina F Falacidina Aumento reversible Faloidina Tamaño Aumento o Disminución Cambios en FS ---- Granularidad Desgranulación Cambios en SS

PARAMETROS CITOMETRICOS DE ACTIVACION PLAQUETARIA Mepacrina Marcador Citométrico Emisión de Fluorescencia Parámetro Cambio detectado Gránulos densos (Número) Liberación del contenido Disminución Complejos gp b/V/IX (Número) Disminución Disminución en superficie Anticuerpos específicos Complejos gp IIb/IIIa (Número) Aumento en superficie Anticuerpos específicos Aumento

PARAMETROS CITOMETRICOS DE ACTIVACION PLAQUETARIA Marcador Citométrico Emisión de Fluorescencia Parámetro Cambio detectado Anticuerpos específicos contra neoepítopos Complejos gp IIb/IIIa Conformación alterada Aumento Modificación de la resonancia de fluorescencia FRET Anticuerpos específicos simultáneos Conformación alterada Complejos gp IIb/IIIa Anticuerpos específicos contra ligandos Unión de ligandos Complejos gp IIb/IIIa Aumento Expresión de LIBS y RIBS Complejos gp IIb/IIIa Anticuerpos específicos Aumento

PARAMETROS CITOMETRICOS DE ACTIVACION PLAQUETARIA Marcador Citométrico Emisión de Fluorescencia Parámetro Cambio detectado Fosfolípidos aniónicos Aumento Annexina V Aumento Anticuerpos específicos contra V y VIIIa Factores de la coagulación Aumento Aumento CD62P (P-Selectina) Aumento Anticuerpos específicos Aumento CD63 (gp53) Aumento Anticuerpos específicos Aumento

PARAMETROS CITOMETRICOS DE ACTIVACION PLAQUETARIA Marcador Citométrico Emisión de Fluorescencia Parámetro Cambio detectado CD107a Anticuerpos específicos Aumento Aumento (LAMP-1) CD 107b Anticuerpos específicos Aumento Aumento (LAMP-2) Gp40 Aumento Anticuerpos específicos Aumento Anticuerpos específicos CD40L Aumento Aumento

PARAMETROS CITOMETRICOS DE ACTIVACION PLAQUETARIA Detección de plaquetas activadas in vivo: Objetivos: Detección de plaquetas activadas circulantes Medición del riesgo protrombótico o prohemorrágico Aspectos metodológicos: El análisis se efectúa en sangre completa periférica Identificación de plaquetas: CD41, CD49 o CD61 con PE Cuantificación de P-selectina: CD62P-FITC Cuantificación del receptor activo de fibrinógeno: PAC-1 FITC

ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA Detección de plaquetas activadas ex vivo: Objetivos: Determinación de la respuesta a agonistas exógenos Estimación del riesgo protrombótico o prohemorrágico Monitorización de tratamientos antiplaquetarios Caracterización del perfil de activación plaquetaria Aspectos metodológicos: El análisis se efectúa en sangre periférica Activación con agonistas plaquetarios: ADP, trombina, etc. Identificación de plaquetas: CD41, CD49 o CD61 con PE Cuantificación de P-selectina: CD62P-FITC Cuantificación del receptor activo de fibrinógeno: PAC-1 FITC

ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA Procedimiento típico de un ensayo de activación plaquetaria TUBO MUESTRA Agonista CD41-PE + CD62P-FITC Solución Stop (Tyrode a +4°C) 40µL None 10µL 5µL 2 mL 1 36µL 4µL of 50µM ADP 2 4 µL of 100µM TRAP-6 TIEMPO 10 min 37°C 5 min Análisis en +/- 15 minutos Análisis de la Activación ex vivo Análisis de la activación in vitro

ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA Anticuerpos CD41/GPIIb

Anticuerpos contra el receptor de trombina ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA Anticuerpos contra el receptor de trombina

ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA

ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA Expresión de P-selectina (CD62P): BASAL BASAL + ADP Contaje FS log CD62P-FITC +ADP CD62P-FITC

ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA Inducción de la activación: Objetivos: ·Medición del riesgo protrombótico o prohemorrágico ·Monitorización de tratamientos antiplaquetarios ·Caracterización del perfil de activación plaquetaria Aspectos metodológicos: ·El análisis se efectúa en sangre periférica ·Activación con agonistas específicos ·Identificación con CD41, CD49 o CD61 con PE ·Medida cinética de la liberación de calcio con Fluo-3 o Fluo-4

ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA Inducción de la activación: +ADP

ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA Inducción de la activación:

ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA Medida de la expresión de superficie procoagulante: Objetivos: Cuantificación de la expresión de fosfatidilserina en la superficie de la plaqueta activada Evaluación de la contribución plaquetaria a la coagulación Aspectos metodológicos: El análisis se efectúa en sangre periférica Identificación con CD41 o CD61 con PE o PC5 Medida de fosfatidilserina con Anexina V-FITC

ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA Medida de la expresión de superficie procoagulante:

ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA Análisis cuantitativo de micropartículas plaquetarias: Objetivos: Detección y cuantificación de fragmentos circulantes de membrana plaquetaria que expresan fosfatidilserina Diferenciar micropartículas activadas y no activadas Evaluación de la contribución plaquetaria a la coagulación Aspectos metodológicos: El análisis se efectúa en sangre periférica Identificación con CD41 o CD61 con PE o PC5 Medida de fosfatidilserina con Annexina V-FITC Método normalizado en Biocytex

ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA BASAL

ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA A23187 67mM

ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA BASAL A23187 67mM

ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA Análisis cuantitativo de micropartículas plaquetarias: Micropartículas plaquetarias Number of Pathological Samples : n = 22 Test A Test B CD61/CD41 Annexin V/CD41 Mean 7745 1362 SD 3474 570 Range 1839 - 13620 400 - 2280 Results expressed in number of events / µl whole blood Micropartículas activadas

EJEMPLO DE ANALISIS CITOMETRICO INTEGRADO DE LA FUNCION PLAQUETARIA ADP ADP RBC Plaquetas B C A A23187 Basal A23187 ADP F Basal Basal ADP D E G