Interferencia de Autoanticuerpos Específicos de Troponina en Diferentes Configuraciones de Estudios de Troponina Cardiaca I. T. Savukoski, E. Engström, J. Engblom, N. Ristiniemi, S. Wittfooth, B. Lindahl, K.M. Eggers, P. Venge y K. Pettersson Junio 2012 www.clinchem.org/cgi/content/article/58/6/1040 © Copyright 2012 by the American Association for Clinical Chemistry

Introducción Troponina Cardiaca I (cTnI) Las troponinas cardiacas (I y T) constituyen la media mas sensible para detectar daño al miocardio reciente o constante. → Biomarcadores recomendados para el diagnóstico de síndrome coronario agudo (ACS) Numerosos ensayos comerciales para cTnl, configurados de manera diferente usados ampliamente en la evaluación clínica de condiciones cardiacas. Las mediciones confiables y consistentes de cTnl pueden ser un desafío. → La heterogeneidad de la cTnl en el sistema sanguíneo, diferencias en interferencias de la matríz de la muestra y difrencias entre ensayos y entre anticuerpos y otros reactivos para ensayos.

Introducción Anticuerpos específicos para troponina cardiaca (cTnAAb) En 5 a 20% de los individuos sin enfermedad cardiaca. cTnAAbs específicos de cTnI, más comúnmente dirigidos contra el fragmento medio de la molécula de cTnl (aa 30-110) (Eriksson et al. 2004) Recomendación de la IFCC Debido a que las partes terminales de N y C de la cTnl, son sensibles a la degradación proteolítica, la IFCC recomienda el uso de anticuerpos que reconozcan los epítopes del fragmento medio en los inmunoensayos de cTnl.

Introducción Objetivo del estudio: Muchos fabricantes de estudios de cTnl actualmente siguen las recomendaciones de la IFCC, por tanto éstos pueden sufrir interferencias de los cTnAAb. El propósito fué investigar si la interferencia puede ser evitada eligiendo de manera diferente los anticuerpos.

Introduccción Pregunta 1 La interferencia de los cTnAAb causa subestimación de las concentraciones de cTnl. ¿En qué situaciones dicha interferencia puede tener una consecuecia clínica? ¿Hasta qué extensión puede ser tolerada dicha interferencia?

Materiales y Métodos Pruebas de recuperación analítica Las muestras divididas en 3 grupos de estudio basados en la recuperación analítica del complejo de troponina (% de cTnl agregada detectada en la muestra dirigida al fragmento medio del ensayo de cTnl. Después son analizados con otros 5 ensayos que usan diferentes epítopes alrededor de la molécula de cTnl. Pruebas con muestras clínicas cTnl endógena medido en muestras de pacientes con ACS sin elevación de ST de la cohorte de FRISC-II con 3 ensayos investigacionales y tres comerciales. Estátus del cTnAA de todas las muestras determinadas con un ensayo cTnAAb (Pettersson et al. 2009)

Materiales y Métodos Figura 1. Representación esquemática del diseño del estudio Para estudios de recuperación analítica, los pacientes fueron divididos en 3 grupos basándose en el resultado del ensayo de investigación de cTnl 1; grupo de baja recuperación (LR, alta interferencia), grupo de recuperación mediana (MR mdiana interferencia) y grupo de recuperación normal (NR, grupo control). Se condujeron estudios adicionales para comparar los ensayos de investigación de cTnl con los comerciales.

Materiales y Métodos Figura 2. Inmunoensayos para cTnI Mapa epítope de anticuerpos usados en los tres ensayos comerciales y 6 de investigación de cTnl. La barra cerca del nombre de ensayo representa la secuencia lineal de aminoácidos de cTnl. Los epítopes de anticuerpos están marcados con líneas cortas debajo de la secuencia de cTnl con locaciones de amino ácidos respectivos y códigos Mab; Trazador de anticuerpos con asteriscos (*). En donde: Stable midfragment = Fragmento medio estable; AxSYM cTnl = cTnl AxSYM; AccuTnl= AccuTnl; Liaison cTnl= cTnl Liaison; Ctnl assay 1= Ensayo de cTnl 1 (etc.)

Materiales y Métodos Pregunta 2 Ver Figura 2 ¿Cuál de los ensayos de investigación es más parecido a los comerciales? Desde que se reportó que el fragmento medio de cTnl es el más afectado comunmente por los cTnAAB, ¿Qué clase de resultados de recuperación podrían ustedes predecir para estos ensays?

Resultados → Los ensayos 1, 3 y 6 de cTnI fueron elegidos para posteriores estudios con pacientes cardiacos P<0.001 P=0.1649 Figura 3. Recuperaciones analíticas (A) y señales cTnAAb (B) de muestras de plasma y suero de individuos (n = 132) sin condiciones cardiacas conocidas La interferencia analítica de los cTnAAbs se redujo cuando las combinaciones epítopes alternativas fueron usadas. Todas las muestras LR, MR y 24 NR fueron positivas para cTnAAb (A las muestras negativas para cTnAAb se les asignó el signo 1) → los resultados de recuperación parecen estar asociados con señales de cTnAAb. En donde: Specific signal from cTnAAb assay (counts) = Señal específica de ensayos de cTnAAb (conteo); Analytical recovery = Recuperación analítica; Assay = Ensayo

← Hasta 20 veces de sobreestimación Resultados ← Hasta 20 veces de sobreestimación En donde: Specific signal from cTnAAb assay (counts) = Señal específica de ensayos de cTnAAb (conteo) Analytical recovery = Recuperación analítica Assay = Ensayo Figura 4. Concentraciones originales de cTnl en muestras de cTnAAb negativo (■) y cTnAAb positivo (□) Los ensayos 1 y 3 realizados de manera similar, mientras que con el ensayo 6 la mayoría de las muestras positivas para cTnAAb se destacan de la dispersoón debido a los altos resultados de cTnl con el ensayo 6 que con el 3. Los ensayos comerciales parecieron desempeñarse de manera similar con el ensayo 3 (el ensayo 6 dando resultados más altos con muestras positivas de cTnAAb) como se ejemplifica con el ensayo de segunda generación AccuTnl.

Resultados Pregunta 3 Estudio restringido para concentraciones relativamente altas de cTnl. ¿Qué clase de resultados podrían esperarse con concentraciones mucho más bajas que están siendo medidas actualmente con ensayos ultrasensibles? Figura 4. Concentraciones normalizadas de cTnl con la cohorte positiva de cTnAAb (n=53) Las concentraciones de cTnl en la cohorte positiva de cTnAAb no fueron significativamente diferentes entre los ensayos de cTnl 1 y 3 pero la concentración media con el ensayo 6 fue de 5.0- y 3.7 veces mayor que en los otros 2 ensayos.

Conclusiones Nueva configuración de anticuerpo tipo 3 (ensayo cTnI 6) = 3 anticuerpos capturados para epítopes en el término N, el fragmento medio y el anticuerpo C-terminus & 1 trazador de anticuerpo para un epítope en la parte terminal N de la terminal regional C Selección de este tipo de ensayo cTnl reduce de manera decisiva la interferencia de cTnAAb. Interferencia en ensayos contemporáneos de cTnl. Debido a que se demostró que las interferencias de cTnAAb por ensayos de investigación se observan también en la práctica clínica, los resultados desafían la recomendación oficial para el desarrollo del ensayo para cTnl.

Conclusiones Pregunta 4 Numerosos fabricantes proporcionan inmunoensayos para la medición de cTnl, pero los resultados de estos ensayos no son siempre intercambiables. Se ha descubierto que el uso de un calibrador común reduce la tendencia en la medición de valores de cTnl, pero el uso de anticuerpos comunes se ha sugerido constantemente para permitir la estandarización aceptable de estos ensayos. Por lo tanto, ¿Debería dirigirse el efecto de los cTnAAb circulatorios hacia la selección de anticuerpos para ensayos de cTnl? ¿Debería re-evaluarse la recomendación de la IFCC?

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