Evaluación de una PCR de locus único a tiempo real como técnica para la detección específica del Staphylococus aureus meticilín resistente en pacientes ingresados en UCI. K.Oberdofer, S.Pohl, M.Frey, K.Heeg, C.Wendt Eur J Clin Microbiol Infect Dis (2006) 25:

INTRODUCCIÓN Detección MRSA: Medios de cultivo: 2-3 díasMedios de cultivo: 2-3 días PCR desde muestras clínicas:PCR desde muestras clínicas: mayor rapidez detección MRSAmayor rapidez detección MRSA > rapidez medidas control infeccioso → reducción extensión.> rapidez medidas control infeccioso → reducción extensión. Primeros métodos mediante PCR → detección 2 genes: mecA: PBP-2mecA: PBP-2 nuc: fragmento específico genoma S.aureus codifica termonucleasanuc: fragmento específico genoma S.aureus codifica termonucleasa Problemas: hay muestras que contienen mezclas MSSA y SCN-MR (gen mecA) → falsos positivosProblemas: hay muestras que contienen mezclas MSSA y SCN-MR (gen mecA) → falsos positivos

INTRODUCCIÓN IDI-MRSA, Infectio Diagnostics, Saint-Foy, Québec, Canadá: Test basado en estudios de análisis secuencial del gen mecA cargado en el cassette cromosómico mec (SCCmec).Test basado en estudios de análisis secuencial del gen mecA cargado en el cassette cromosómico mec (SCCmec). PCR mediante sondas de locus único.PCR mediante sondas de locus único. Adaptado para ciclador a tiempo real Smart-Cycler II.Adaptado para ciclador a tiempo real Smart-Cycler II. Aprobado por FDA en mayo 2004.Aprobado por FDA en mayo Certificado por UE, disponible Europa enero 2005.Certificado por UE, disponible Europa enero Permite trabajar con muestras directas nasales.Permite trabajar con muestras directas nasales. Test probado en USA y Canadá, altas prevalencias MRSA (18-25%).Test probado en USA y Canadá, altas prevalencias MRSA (18-25%).

INTRODUCCIÓN Objetivo: Probarlo en poblaciones de baja prevalencia MRSA → UCI Hospital Universitario de Heidelberg.Probarlo en poblaciones de baja prevalencia MRSA → UCI Hospital Universitario de Heidelberg. Comparar el test con cultivos convencionales de muestras nasales, faríngeas y heridas.Comparar el test con cultivos convencionales de muestras nasales, faríngeas y heridas.

MATERIALES Y MÉTODOS Hospital Universitario Heidelberg: 1600 camasHospital Universitario Heidelberg: 1600 camas PacientesPacientes UCIUCI Cirugía cardíacaCirugía cardíaca Cirugía abdominal/trasplante hepáticoCirugía abdominal/trasplante hepático GastroenterologíaGastroenterología Unidades de Cuidados Intermedios: GastroenterologíaUnidades de Cuidados Intermedios: Gastroenterología MuestrasMuestras Torundas nasales en medio Stuart líquido → PCR tiempo realTorundas nasales en medio Stuart líquido → PCR tiempo real Torundas nasales, faríngeas y heridas (solo lesiones crónicas) en medio Amies sólido → cultivo convencional MRSATorundas nasales, faríngeas y heridas (solo lesiones crónicas) en medio Amies sólido → cultivo convencional MRSA

MATERIALES Y MÉTODOS IDI-MRSA:IDI-MRSA: Procesadas a diario L-V, desde 11 AMProcesadas a diario L-V, desde 11 AM Resultados comunicados a UCI 2-5 PM mismo día.Resultados comunicados a UCI 2-5 PM mismo día. Procesamiento inicial:Procesamiento inicial: Vortear en 1 ml solución tampón muestra.Vortear en 1 ml solución tampón muestra. Transferir a tubo de lisisTransferir a tubo de lisis Centrifugar 21000g x 5’Centrifugar 21000g x 5’ Añadir 50 μl tampón a tubo de lisisAñadir 50 μl tampón a tubo de lisis Vortear 5’ hasta lisis bacterianaVortear 5’ hasta lisis bacteriana Centrifugado rápido, calentar 2’ a 95ºCCentrifugado rápido, calentar 2’ a 95ºC Guardar en hielo hasta análisis PCR tiempo realGuardar en hielo hasta análisis PCR tiempo real

MATERIALES Y MÉTODOS IDI-MRSA:IDI-MRSA: Procesamiento PCR:Procesamiento PCR: Smart Cycler II.Smart Cycler II. Añadir 2.8 μl DNA extraído a tubo lisis y 25 μl reconstituyente liofilizado, a tubo específico PCR Smart Cycler.Añadir 2.8 μl DNA extraído a tubo lisis y 25 μl reconstituyente liofilizado, a tubo específico PCR Smart Cycler. Tiempo: 60’ (45 ciclos)Tiempo: 60’ (45 ciclos) Causas de repetición del control interno:Causas de repetición del control interno: Presencia de inhibidoresPresencia de inhibidores Control positivo o negativo inválidosControl positivo o negativo inválidos

MATERIALES Y MÉTODOS Detección MRSA mediante cultivo:Detección MRSA mediante cultivo: Cultivo inmediato tras recepción muestraCultivo inmediato tras recepción muestra Resultados en 3 díasResultados en 3 días Inoculaciones:Inoculaciones: Agar Columbia (5% sangre oveja) y MSA, 48h a 36ºC.Agar Columbia (5% sangre oveja) y MSA, 48h a 36ºC. Broth enriquecido con tripticasa soja, sin aditivos selectivos, 48h a 36ºC.Broth enriquecido con tripticasa soja, sin aditivos selectivos, 48h a 36ºC. Turbidez 24h → resiembra MSA, 48hTurbidez 24h → resiembra MSA, 48h Turbidez 48h → resiembra agar sangre, 24hTurbidez 48h → resiembra agar sangre, 24h Colonias sospechosas S.aureus → aglutinación látex (Pastorex Staph Plus) y coagulasa.Colonias sospechosas S.aureus → aglutinación látex (Pastorex Staph Plus) y coagulasa. Test oxacilina: agar Múller-Hinton 6 mg/l oxacilina y NaCl 4%, 24h a 30ºC.Test oxacilina: agar Múller-Hinton 6 mg/l oxacilina y NaCl 4%, 24h a 30ºC.

MATERIALES Y MÉTODOS Detección genes mecA y nuc por PCR:Detección genes mecA y nuc por PCR: Si discordancia entre PCR tiempo real y cultivos → PCR múltiple detección presencia o ausencia mecA y nuc.Si discordancia entre PCR tiempo real y cultivos → PCR múltiple detección presencia o ausencia mecA y nuc. Extracción DNA:Extracción DNA: Suspender 2-3 colonias en fosfato salino, calentar 15’ a 98ºCSuspender 2-3 colonias en fosfato salino, calentar 15’ a 98ºC Quiagen blood kitQuiagen blood kit Tomar 2 μl DNA extraído para PCRTomar 2 μl DNA extraído para PCR

MATERIALES Y MÉTODOS Detección genes mecA y nuc por PCR:Detección genes mecA y nuc por PCR: Primers:Primers: mecA1 (5’-GTTGTAGTTGTCGGGTTTGG-3’)mecA1 (5’-GTTGTAGTTGTCGGGTTTGG-3’) mecA2 (5’-CGGACGTTCAGTCATTTCTAC-3’)mecA2 (5’-CGGACGTTCAGTCATTTCTAC-3’) nuc Sa442-1 (5’-AATCTTTGTTCCTACACGATATTC-3’)nuc Sa442-1 (5’-AATCTTTGTTCCTACACGATATTC-3’) nuc Sa442-2: (5’-CGTAATGAGATTTCAGTAGATAATACAAACA-3’)nuc Sa442-2: (5’-CGTAATGAGATTTCAGTAGATAATACAAACA-3’) PCR cycling:PCR cycling: Desnaturalización inicial 5’ a 94ºCDesnaturalización inicial 5’ a 94ºC 40 ciclos de 30’’ a 94ºC, 30’’ a 55ºC y 60’’ a 72ºC, extensión final a 72ºC 10’.40 ciclos de 30’’ a 94ºC, 30’’ a 55ºC y 60’’ a 72ºC, extensión final a 72ºC 10’. Electroforesis en gel agarosa: detección productos PCR.Electroforesis en gel agarosa: detección productos PCR.

MATERIALES Y MÉTODOS Tipado mediante Electroforesis de Campo Pulsante (PFGE)Tipado mediante Electroforesis de Campo Pulsante (PFGE) Tipado molecular tras digestión DNA mediante enzima restricción SmaI, por PFGE usando CHEF (Contour-Clamped Homegeneus Electric Field).Tipado molecular tras digestión DNA mediante enzima restricción SmaI, por PFGE usando CHEF (Contour-Clamped Homegeneus Electric Field). Spa Typing.Spa Typing. Test sensibilidad:Test sensibilidad: BD Phoenix Automated Microbiology System, panel combinado PMIC/ID-21BD Phoenix Automated Microbiology System, panel combinado PMIC/ID-21 Valores CMI interpretados según guías CLSI.Valores CMI interpretados según guías CLSI. Análisis estadístico:Análisis estadístico: Sensibilidad, especificidad, VPP, VPN de la PCR tiempo real muestras nasales, comparada con cultivos de muestras nasales, faríngeas y heridas.Sensibilidad, especificidad, VPP, VPN de la PCR tiempo real muestras nasales, comparada con cultivos de muestras nasales, faríngeas y heridas.

RESULTADOS 320 pacientes:320 pacientes: UCI cirugía cardíaca: 101UCI cirugía cardíaca: 101 UCI cirugía abdominal: 84UCI cirugía abdominal: 84 UCI gastroenterología: 40UCI gastroenterología: 40 Unidad Cuidados Intermedios gastroenterología: 95Unidad Cuidados Intermedios gastroenterología: 95 Muestras de heridas: 12 (3.9%) pacientesMuestras de heridas: 12 (3.9%) pacientes Pacientes colonizados MRSA antes estudio: 2Pacientes colonizados MRSA antes estudio: 2 1 fue tratado con mupirocina tópica, se tomaron muestras 4 días post-tto, IDI-MRSA +, no se pudo cultivar. Excluído → el estudio no incluye pacientes bajo tto.1 fue tratado con mupirocina tópica, se tomaron muestras 4 días post-tto, IDI-MRSA +, no se pudo cultivar. Excluído → el estudio no incluye pacientes bajo tto.

RESULTADOS 28 (8.8%) resultados inválidos PCR tiempo real sobre muestras nasales al primer intento:28 (8.8%) resultados inválidos PCR tiempo real sobre muestras nasales al primer intento: Causa: presencia de inhibidoresCausa: presencia de inhibidores Procedimiento: se congeló a -20ºC y se repitió test al día siguiente.Procedimiento: se congeló a -20ºC y se repitió test al día siguiente. 13/28 dieron resultado válido Ø13/28 dieron resultado válido Ø 15/28 dieron resultados inválidos al segundo intento, sin crecimiento MRSA en los cultivos.15/28 dieron resultados inválidos al segundo intento, sin crecimiento MRSA en los cultivos.

RESULTADOS 320 pacientes:320 pacientes: 1 exclusión por estar bajo tto1 exclusión por estar bajo tto 15 exclusiones por resultados inválidos PCR15 exclusiones por resultados inválidos PCR 304 muestras válidas304 muestras válidas Resultados IDI-MRSA:Resultados IDI-MRSA: Negativo: 288Negativo: 288 Positivo: 16Positivo: 16

RESULTADOS Resultados Cultivo:Resultados Cultivo: MRSA +: 13 casosMRSA +: 13 casos 12 también + con PCR12 también + con PCR 1 negativo con PCR, muestra faríngea1 negativo con PCR, muestra faríngea Crecimiento MRSA:Crecimiento MRSA: 3: nasal sólo3: nasal sólo 8: nasal y faríngeo8: nasal y faríngeo 1: nasal, faríngeo y heridas1: nasal, faríngeo y heridas 1: faríngeo sólo1: faríngeo sólo

RESULTADOS Muestras nasales:Muestras nasales: S.aureus en 90 muestras:S.aureus en 90 muestras: 12: PCR +, confirmado como MR mediante test oxacilina12: PCR +, confirmado como MR mediante test oxacilina Otras muestras:Otras muestras: S.aureus en 78 muestras faríngeas y heridas:S.aureus en 78 muestras faríngeas y heridas: 4 (5.1%): PCR +, cultivo MR Ø, mecA Ø, PCR desde colonias Ø → falsos positivos.4 (5.1%): PCR +, cultivo MR Ø, mecA Ø, PCR desde colonias Ø → falsos positivos. PCR sobre colección cepas Hospital Heidelberg:PCR sobre colección cepas Hospital Heidelberg: 80/86 PCR +80/86 PCR +

RESULTADOS IDI-MRSA (muestra nasal) SensibilidadEspecificidadVPPVPN PositivaNegativa Cultivo muestra nasal, faríngea y heridas MRSA %98.6%75.0%99.6% Ø4287 Cultivo muestra nasal unicamente MRSA %98.6%75.0%100% Ø4288

CONCLUSIONES En poblaciones con baja prevalencia MRSA, IDI- MRSA mantiene buenos resultados de sensibilidad, especificidad y VPN.En poblaciones con baja prevalencia MRSA, IDI- MRSA mantiene buenos resultados de sensibilidad, especificidad y VPN. Test rápido y útil para descartar presencia MRSA en muestras nasales.Test rápido y útil para descartar presencia MRSA en muestras nasales. Tasa inhibición para PCR a tiempo realTasa inhibición para PCR a tiempo real Estudios para aprobación FDA: 4.5%Estudios para aprobación FDA: 4.5% En nuestro estudio: 11% → contaminación sangre o secreciones nasalesEn nuestro estudio: 11% → contaminación sangre o secreciones nasales

CONCLUSIONES VPP 75%:VPP 75%: Se recomienda confirmar los positivos mediante cultivos de esas muestrasSe recomienda confirmar los positivos mediante cultivos de esas muestras Se aislarán esos pacientes hasta confirmación del resultadoSe aislarán esos pacientes hasta confirmación del resultado Falsos positivos causados por MSSA evitables añadiendo PCR múltipleFalsos positivos causados por MSSA evitables añadiendo PCR múltiple Falsos positivos por otros SCN inevitablesFalsos positivos por otros SCN inevitables Coste alto, resultados en 90’ faciles de interpretarCoste alto, resultados en 90’ faciles de interpretar Coste-eficacia: beneficios 5 veces > coste (contando coste por aislamiento temporal pacientes falsos positivos).Coste-eficacia: beneficios 5 veces > coste (contando coste por aislamiento temporal pacientes falsos positivos).

Joaquín Granados Ortega M.I.R. de Microbiología y Parasitología Hospital General de Castellón Joaquín Granados Ortega M.I.R. de Microbiología y Parasitología Hospital General de Castellón