DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS Raúl Gil Orts MIR 3 HOSPITAL VIRGEN DE LOS LIRIOS

ENFERMEDAD DE CHAGAS INTRODUCCIÓN - Causada por el protozoo flagelado Trypanosoma cruzi - Distribuida por América Central y del Sur donde es endémica - La OMS estima que la población en riesgo es de 60 millones - entre 9 y 12 millones están infectados - cada año provoca 12500 muertes - Vector: insectos hematófagos Familia Reduviidae -> Triatominos - Transmisión: transmiten la enfermedad cuando defecan junto a la picadura, el parásito presente en las heces penetra a través de las lesiones en piel o mucosas - Otras vías de transmisión son la vertical (4%-7%)o las transfusiones sanguíneas - menos frecuente son: - a través de trasplante de órganos - transmisión oral por alimentos contaminados - accidentes laboratorio

Triatomino “Vinchuca” Vector: insectos hematófagos - Orden Hemiptera - Familia Reduviidae -> Triatoma infestans Triatomino “Vinchuca”

ENFERMEDAD DE CHAGAS FORMAS EVOLUTIVAS Amastigotes forma no flagelada de multiplicación intracelular Epimastigotes Forma de multiplicación en el vector Tripomastigote Presente sólo en sangre

ENFERMEDAD DE CHAGAS MANIFESTACIONES CLÍNICAS Y FASES DE LA ENFERMEDAD Fase aguda - 1-2 semanas después de la infección - mayoría veces asintomática - cuando es sintomática: - Chagoma o nódulo cutáneo local (en picadura) - fiebre prolongada, linfoadenopatías - MAG, hepatoesplenomegalia, miocarditis, encefalitis Fase crónica - Clínicamente asintomática - Puede permanecer latente durante décadas o durante toda la vida (f. indeterminada 60-70% casos) - En un 30% - 40% pacientes, entre 10 y 30 años tras la exposición, aparecen síntomas, las más habituales cardiopatía y alteración digestiva - Puede afectar SNC produciendo demencia - Con los años puede producir la muerte súbita o insuficiencia cardíaca por la destrucción del músculo cardiaco

ENFERMEDAD DE CHAGAS DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO Métodos Diagnósticos en la fase aguda 1. Métodos directos sin concentración previa 2. Métodos directos de concentración 2.1 Microhematocrito 2.2 Prueba de Strout Métodos Diagnósticos en la fase crónica 3. Serología Otros métodos parasitológicos y métodos de Biología Molecular - Utilizados en cualquier fase, con parasitemia baja y no se detecte por otros métodos - Indicaciones: - dudas diagnósticas - aislamiento para estudios de investigación - Métodos: 4. Xenodiagnóstico 5. Cultivo in vitro 6. PCR

ENFERMEDAD DE CHAGAS DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO Métodos diagnósticos en la fase aguda 1. Métodos parasitológicos directos sin concentración previa - Examen en fresco - Se deben buscar en sangre periférica - Entre portaobjeto y cubreobjeto colocando 5 µL de sangre - observar el movimiento de las formas parasitas a 400 aumentos - Otras opciones son el frotis o la gota gruesa - a partir de sangre, mejor sin anticoagulantes - se tiñe con Giemsa y observamos al microscopio a 400 o 1000 aumentos

ENFERMEDAD DE CHAGAS DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO Métodos diagnósticos en la fase aguda 2. Métodos directos de concentración 2.1 Microhematocrito - de elección en la infección congénita - Sensibilidad 85% Observamos movimiento

ENFERMEDAD DE CHAGAS DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO Métodos diagnósticos en la fase aguda 2. Métodos directos de concentración 2.2 Prueba de Strout - concentrar los parásitos a partir de 3 mL de sangre sin anticoagulante - se deja el tubo a 37ºC durante 2 horas -> se retrae el coágulo - se transfiere el suero a otro tubo y se centrifuga varios ciclos - se observa el sedimento en fresco o tras realizar un frotis y teñirlo con Giemsa - la sangre debe ser reciente y observada dentro de las 4-8 horas de su obtención - puede ser conservada a 4°C o Temperatura ambiente hasta ser procesada

ENFERMEDAD DE CHAGAS DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO Métodos diagnósticos en la fase crónica - parasitemias son bajas e intermitentes 3. Serología - método de elección en la fase crónica - determinación de inmunoglobulinas específicas de la clase IgG totales - test convencionales - inmunofluorescencia indirecta IFI - emplea como antígeno la totalidad del parásito - presenta más reacciones cruzadas -> menor especificidad - hemoaglutinación indirecta - emplea mezclas de fracciones antigénicas del parásito - ensayos inmunoenzimáticos (ELISA) - test no convencionales - utilizan antígenos purificados, recombinantes o péptidos sintéticos - pruebas rápidas de inmunocromatografía

IFI HEMOAGLUTINACIÓN

ELISA

Serología - no existe un consenso general que establezca las técnicas de referencia y ningún test está considerado el “gold standard” para confirmar el diagnóstico de infección - en ciertas circunstancias ninguna de las técnicas descritas sirve como marcador de curación o evolución de la infección (seroconversión tarda años) - La OMS recomienda que, al menos, se realicen dos pruebas en paralelo que utilicen antígenos o principios distintos. Un individuo estará infectado cuando el resultado de dos test sea positivo. - obtención de resultados discordantes, indeterminados o no concluyentes, que aparecen cuando los títulos son bajos y cercanos al umbral (imprecisión) - cuando dos pruebas serológicas distintas no sean suficientes se debe recurrir a una tercera técnica - los expertos recomiendan la IFI (S 95% y E 100%)

Otros métodos parasitológicos y métodos de Biología molecular - pueden ser utilizados en cualquier fase con parasitemia baja y no se detecte por otros métodos. - se indican cuando hay dudas diagnósticas o cuando se requiere el aislamiento del parásito para estudios de investigación Métodos: 4. Xenodiagnóstico 5.cultivo in vitro 6.PCR

4. XENODIAGNÓSTICO: - se utiliza al propio vector para que en su interior se produzca la multiplicación - se utilizan 40 redúvidos repartidos en 2 frascos que se ponen en contacto con la piel del paciente 30 min - posteriormente se mantienen en el laboratorio durante 30, 60, 90 días y se analizan las heces u orina en busca de tripomastigotes en movimiento. - actualmente se realiza de forma artificial - Sensibilidad es muy elevada y varía entre un 9% hasta un 87.5%

2. CULTIVO IN VITRO - Objetivo: la multiplicación de las formas parásitas presentes en la sangre del paciente. - Medios utilizados: - el NNN (Novy-McNeal-Nicolle) - medio de LIT (Liver Infusion Trytose) suplementado con un 20% de suero bovino fetal - Sensiblidad entre 40-50% PROCEDIMIENTO - Se utilizan 30mL de sangre recogida con heparina en días alternos - se centrifuga y se separa el plasma - el sedimento se lava con LIT y se distribuye en 6 tubos con 3 mL de medio LIT - el plasma se centrifuga y el sedimento se siembra en 3 mL de LIT - Se mantienen en estufa a 28ºC - se examinan mensualmente - se mantienen durante 3 meses antes de dar resultado como negativo - si hay crecimiento se observan epimastigotes y tripomastigotes si el cultivo es viejo

PCR - Capaz de detectar parasitemias muy bajas e incluso fragmentos del parásito - En países no endémicos se utiliza - para el control de posible reactivación postrasplante - para el diagnóstico de Chagas congénito - En la fase crónica es una prueba de confirmación, complementaria a la serología - se utiliza para el seguimiento de curación post-tratamiento Tipos de muestras: - fase aguda: sangre, suero, plasma, LCR, biopsias tejido cardiaco, biopsia de placenta o cordón (congénita) - fase crónica: sangre o plasma, o capa leucocitaria Conservación de la muestra - Importante para mejorar resultados - conservar a 4ºC o congelada - Sangre total-> se debe mezclar con tampón guanidina 6 M-EDTA 0.2 M - Se puede conservar a T°C ambiente o nevera - Se produce hemólisis-homogenización ADN- inhibición ADNasas

PCR En condiciones óptimas la sensibilidad en fase crónica es del 50% - Nested PCR mayor sensibilidad que PCR simple - altamente Sensible - consume mucho tiempo - falsos positivos por amplicones - PCR a tiempo real - detecta a la vez que amplifica - rápida -reduce el riesgo de contaminaciones - la cuantificación es limitada en las fases indeterminadas - potencial - en diagnóstico de infecciones congénitas - control de parasitemia antes y después tratamiento - detección precoz de recaídas en situaciones de inmunosupresión - no hay ninguna PCR comercializada - no hay consenso general para estandarizar y utilizar una misma PCR

Algoritmo Fase aguda Fase crónica Diagnóstico parasitológico Diagnóstico serológico PCR Efectuar 2 técnicas serológicas validadas Cultivo Xenodiagnóstico Exámen directo Ex. Fresco frotis Gota gruesa T. Strout Microhematocrito

DIAGNÓSTICO CHAGAS CONGÉNITO Se realiza cuando madre tiene Diagnóstico de Chagas agudo o crónico Pruebas: - a) microhematocrito - sangre preferente de talón - paralelamente se puede realizar exámen en fresco, frotis o gota gruesa - en caso negativos indicado cultivo y una PCR y seguimiento clínico y parasitológico hasta los 9 meses - b) serología - cuando las anteriores hayan resultado negativas - realizar 2 pruebas serológicas validadas - realizar a partir de los 9 meses (anticuerpos maternos) Otras detección de parásitos en placenta o líquido amniótico por histología o por PCR no siempre se puede asociar a infección congénita

Algún criterio POSITIVO Chagas congénito Racién nacido Exámen clínico -Microhematocrito -otros exámenes parasitológicos PCR Serología a los 9 meses de vida Algún criterio POSITIVO INFECTADO Todos los criterios NEG NO INFECTADO Tratamiento benznidazol 2 meses Control clínico cada 2-3 semanas Control analítico a los 15 días y cada 4 sem Control serológico hasta negativización Alta

GRACIAS