UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE INGENIERÍA PESQUERA PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS Y DILUYENTES UTILIZADOS EN ALIMENTOS M. Sc. CÉSAR JULIO CÁCEDA QUIROZ

INTRODUCCIÓN Los análisis microbiológicos permiten cuantificar e identificar a los M´os que contaminan los alimentos, Comprometiendo la salud de las personas y causando el deterioro de su calidad.

OBJETIVOS Obtener adiestramiento en la preparación de muestras de alimentos. Tener conocimiento de los diluyentes más utilizados en alimentos

PREPARACIÓN DE MATERIAL DE LAB. PARA ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DESCONTAMINACIÓN Y DESCARTE DE RESIDUOS CONTAMINADOS Esterilizar en autoclave a 121ºC por 30 min. observando los siguientes cuidados: Aflojar las tapas de frascos con tapa rosca. Adicionar agua o solución detergente al estuche de descarte de pipetas.

LAVADO Los detergentes más usados para el lavado de vidrio y utensilios: detergentes aniónicos. Principalmente aquellos que contienen compuestos alcalinos, como: Silicatos Carbonatos, y Fosfatos

LAVADO Se puede utilizar solución sulfocrómica o solución alcohólica 1 N de NaOH, para: La limpieza de utensilios que no permite una introducción de cepillos (pipetas). Para la remoción de residuos más resistentes a la acción de los detergentes.

Solución Sulfocrómica 60 g K2Cr2O7 200 ml agua destilada 800 ml Ac. Sulfúrico Baño de hielo Solución de NaOH 1N 40 g NaOH Baño de agua fría 100 ml agua destilada

ENJUAGE DEL MATERIAL PARA ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS Los residuos de detergentes u otro agente pueden interferir con los resultados del análisis: Alterando las características de los medios de cultivo, o Inhibiendo el crecimiento de M´os.

ENJUAGE DEL MATERIAL PARA ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS Como los detergentes y soluciones de limpieza tienen afinidad por la superficie del vidrio y otros utensilios: Su completa remoción exige: 6 a 12 enjuagues sucesivos en agua corriente, Seguido de una a varias enjuagues con agua destilada.

PROCEDIMIENTO PARA EL LAVADO Remover todo el material descontaminado. Sumergir todo el material en solución detergente y dejar remojar, mínimo por 2 horas, Dependiendo del grado de adherencia del material a ser removido.

PROCEDIMIENTO PARA EL LAVADO Los tubos Durham deben colocarse en frasco separado, resistente al calor, y: Ser sometido a la acción del vapor fluente por 15 minutos.

ACONDICIONAMIENTO Placas Petri: Deben ser acondicionadas: En estuches porta placas de aluminio o acero inoxidable, o En papel kraft En grupos de hasta 10 placas.

ACONDICIONAMIENTO Pipetas: Colocar en la boca un pedazo de algodón. Acondicionar en estuches porta pipetas de aluminio o acero inoxidable, En grupos de la misma capacidad, con las puntas para abajo.

ACONDICIONAMIENTO Tubos de ensayos: Colocar un tapón de algodón en la boca, o la tapa rosca, si son tubos con tapa rosca. Acondicionar en grupos, recordando aflojar las tapas de los tubos tapa rosca. Cubrir con papel kraft y amarrar con pabilo.

ACONDICIONAMIENTO Los frascos de homogeneización y otros frascos vacíos que tiene tapón de algodón: Cubrir la abertura con papel kraft y amarrar con pabilo, individualmente. Las espátulas, pinzas, tijeras y demás utensilios: Envolver individualmente en papel kraft.

ESTERILIZACIÓN Todo material de laboratorio vacío puede ser esterilizado: En autoclave: 121ºC por 15 minutos. En estufa de esterilización: 160 ºC por dos horas 170 ºC por una hora. 180 ºC por 30 minutos

ESTERILIZACIÓN Cada frasco u otro utensilio no alcanza esas temperaturas, Principalmente en el interior de los estuches de acero inoxidable, o Cuando la estufa o autoclave están muy llenas.

ESTERILIZACIÓN Por ello se recomienda que toda el material de vidrio y demás material vacío, Permanezca por lo menos 2 horas a 170 ºC o 30 minutos a 121 ºC.

OBSERVACIONES PRÁCTICAS Pipetas con capacidad menor a 1,0 ml nunca debe ser esterilizado en estufa: Porque las altas Tº provocan alteraciones significativas en las medidas del volumen. El procedimiento correcto es esterilizar en autoclave a 121 ºC por no más de 15 minutos.

OBSERVACIONES PRÁCTICAS Todos los tubos de ensayo, frascos, etc. deben ser esterilizados con las tapas aflojadas. Después de terminada la esterilización las tapas deben ser completamente cerrada.

OBSERVACIONES PRÁCTICAS En el caso de los medios de cultivo, diluyentes y reactivos, esperar que la presión baje a cero: Antes de descargar el vapor, en caso contrario podrá ocurrir pérdida de líquido por evaporación.

MATERIAL DE VIDRIO NUEVO Debe ser sumergida y mantenida por 24 horas en agua destilada. Luego ser enjuagada en una nueva batería de agua destilada y sometida a una prueba de pH, Antes de ser utilizada.

MATERIAL DE VIDRIO NUEVO Las tapas de plástico de los tubos de rosca o de otros frascos: Deben pasar por un tratamiento para la remoción de residuos tóxicos.

MATERIAL DE VIDRIO NUEVO Para ello sumergir en agua destilada, autoclavar a 121 ºC/15 minutos y enjuagar con agua destilada. Repetir este procedimiento mas de una vez.

OBSERVACIONES PRÁCTICAS Las placas Petri deben envolverse en papel kraft, porque: Absorbe el vapor de condensación, Seca rápidamente en la estufa de secado.

VERIFICACIÓN DE pH En pH neutro = verde pH ácido (pH ≤ 6,5) = amarillo Tomar algunos frascos del material lavado, principal- los tratados con solución sulfocrómica o de NaOH Adicionar algunas gotas de solución al 0,04% de azul de bromotimol, observando el color: En pH neutro = verde pH ácido (pH ≤ 6,5) = amarillo pH alcalino (pH ≥ 7,3) = azul.

VERIFICACIÓN DE pH La solución 0,04% de azul de bromotimol se prepara de la siguiente manera: Disolver 0,1 gramo de azul de bromotimol en 16,0 ml de solución 0,01 N de NaOH, y En un balón volumétrico, completar el volumen para 250,0 ml con agua destilada.

PRUEBA DE RESIDUOS TÓXICOS Preparar 3 grupos de placas Petri de la siguiente forma: Grupo A: Lavar 6 placas de la forma usualmente utilizada en el laboratorio.

PRUEBA DE RESIDUOS TÓXICOS Grupo B: Lavar 6 placas de la manera usualmente utilizada en el laboratorio. Luego, someter a 12 enjuagues adicionales, con 12 porciones diferentes de agua destilada.

PRUEBA DE RESIDUOS TÓXICOS Grupo C: Lavar 6 placas Petri y dejar secar sin enjuagar la solución detergente.

LA REMOCIÓN DE RESIDUOS Grupo A Grupo B Grupo C Plaquear medio TSA en cada una de las placas de los 3 grupos Cultivo 24 hrs. E. coli o E. aerogenes Realizar diluciones y sembrar 1,0 ml por placa Sacar un promedio de las UFC de las placas de cada grupo y comparar las medias obtenidas: Si la diferencia entre A, B y C < del 15 % = Detergente utilizado no es tóxico contra los M’os. Si la diferencia entre A y C >= al 15 % = El detergente presenta efecto tóxico contra los M’os. Si la diferencia entre A y B >= 15 % = El método de enjuague utilizado no es eficiente Si la diferencia entre A y B < 15 % = El lavado y enjuague son eficiente para remover los residuos.

LA REMOCIÓN DE RESIDUOS Para evaluar la presencia de residuos en tubos o frascos: Cultivar por 24 hrs a 35 ºC un cultivo de E. coli o E. aerogenes, en caldo nutritivo o TSB. Acondicionar en 3 grupos, lavados de la misma forma como los grupos A, B y C de placas Petri. Los resultados se comparan de forma análoga a la utilizada en las placas Petri.

COLECTA, TRANSPORTE Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS COLECTA DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS ACONDICIONADOS EN EMBALAJES INDIVIDUALES Los envases individuales deben ser colectadas y transportadas al laboratorio: En su envase comercial original, Cerrado e intacto.

COLECTA, TRANSPORTE Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS COLECTA DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS ACONDICIONADOS EN EMBALAJES INDIVIDUALES Si el embalaje unitario del producto contiene: Una cantidad de alimento menor a dos veces el peso o volumen de la unidad analítica, Se recomienda colectar varios embalajes unitarias, como parte de una misma unidad de muestra.

COLECTA, TRANSPORTE Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS COLECTA DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS ACONDICIONADOS EN EMBALAJES INDIVIDUALES En el momento del análisis: Juntar el contenido de los diversos embalajes en un único frasco estéril, Mezclarlo bien y luego retirar la unidad analítica.

COLECTA, TRANSPORTE Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS COLECTA DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS ACONDICIONADOS EN EMBALAJES INDIVIDUALES Si el producto no permite la mezcla: Se debe tomar de cada uno de los embalajes unitarias, Porciones de peso aproximadamente igual, para componer la unidad analítica.

COLECTA DE MUESTRAS DE ALIMENTOS ACONDICIONADOS EN EMBALAJES NO INDIVIDUALES En caso de que los alimentos estén contenidos en tanques o en envases grandes: Transferir porciones representativas de la masa total en frascos estériles.

Criterios para la selección y preparación de frascos de colecta COLECTA DE MUESTRAS DE ALIMENTOS ACONDICIONADOS EN EMBALAJES NO INDIVIDUALES Criterios para la selección y preparación de frascos de colecta Se debe utilizar frascos con tapas a prueba de fugas, Autoclavables o pre-esterilizados, como bolsas de plástico estériles.

COLECTA, TRANSPORTE Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS Una unidad de muestra debe contener como mínimo 2 veces la unidad analítica. Se prefiere de 3 a 4 veces ese valor, para: La separación de la contra muestra, y Prevención de posibles pérdidas.

COLECTA, TRANSPORTE Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS Usualmente 200 g de alimentos sólidos ó 300 a 500 ml de productos líquidos: Son cantidades suficientes para la mayoría de alimentos. El frasco de colecta debe llenarse, como máximo, las ¾ partes de su capacidad, para poder mezclar.

COLECTA, TRANSPORTE Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS Los frascos y utensilios utilizados en la colecta de las muestras, de preferencia: Esterilizar en autoclave: 121 ºC/30 minutos, o Estufa de esterilización: 170 ºC/2 horas.

COLECTA, TRANSPORTE Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS Otros métodos que pueden ser utilizados como alternativa son: Vapor fluente: 100 ºC/ 1 hora Flamear a la llama Inmersión en etanol de 70% y combustión del alcohol (no elimina las esporas)

COLECTA, TRANSPORTE Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS Otros métodos que pueden ser utilizados como alternativa son: Inmersión en solución de hipoclorito de sodio (cc mínima: 100 ppm) por 30 segundos, Seguida de 6 a 12 enjuagues con agua destilada estéril.

COLECTA DE MUESTRAS DE AGUA Las muestras de agua clorada Generalmente tienen cloro residual, que debe ser neutralizado después de la colecta. Adicionar 0,1 ml de una solución al 10% de tiosulfato de sodio (Na2S2O3) al frasco, antes de esterilizarlo. Esto por cada 100 ml de muestra.

COLECTA DE MUESTRAS DE AGUA Las muestras de agua clorada Esta cantidad es suficiente para neutralizar 15 mg de cloro residual por litro de muestra. Si se colecta agua de una cañería de agua: Limpiar externamente con etanol de 70% y flamear. Dejar fluir el agua por 2-3 minutos antes de la colecta.

INFORMACIÓN QUE DEBE ACOMPAÑAR A LAS MUESTRAS Tipo de muestra y proceso utilizado en la fabricación. Fabricante/ fecha de fabricación/ código del lote. Interesado solicitante del análisis. Datos del local de colecta de muestra. Razón del análisis.

TRANSPORTE DE MUESTRAS PARA SU ANALISIS Alimentos comercialmente estériles y herméticamente envasados Pueden ser transportados y almacenados a Tº ambiente, Protegidos a la exposición a Tº superiores a 45 ºC

TRANSPORTE DE MUESTRAS PARA SU ANALISIS Alimentos con baja actividad de agua (deshidratados, secos o concentrados) Pueden ser transportados y almacenados a Tº ambiente: Deben ser protegidos contra la humedad.

TRANSPORTE DE MUESTRAS PARA SU ANALISIS Alimentos perecibles comercializados en forma refrigerada (no congelada) Deben ser transportados y mantenidos en refrigeración hasta el momento de su análisis. Como regla general, estas muestras no deben ser congeladas, y El tiempo entre la colecta y el análisis no debe sobrepasar las 36 horas.

TRANSPORTE DE MUESTRAS PARA SU ANALISIS Muestras de ostras, mejillones, mariscos, etc. (moluscos de concha) comercializadas en forma refrigerada, sin congelamiento: Deben ser analizados dentro de un máximo de 6 horas después de la colecta, y no ser congeladas. En ninguna circunstancia las muestras deben ser examinadas con más de 24 horas transcurridas a partir de la colecta.

TRANSPORTE DE MUESTRAS PARA SU ANALISIS Muestras de agua en general Deben mantenerse refrigeradas, no congeladas. Analizadas de un máximo de 30 horas después de la colecta. Muestras de agua embotellada pueden transportarse y almacenadas a Tº ambiente.

TRANSPORTE DE MUESTRAS PARA SU ANALISIS Muestras de agua en general Una vez abierta el envase, las muestras deben ser refrigeradas, y Analizadas en un máximo de 24 horas

TRANSPORTE DE MUESTRAS PARA SU ANALISIS Muestras de huevos líquido refrigerado Analizados dentro de 4 horas después de la colecta; no congelar. Muestra de producto vegetales fermentados o acidificados no comercialmente estéril: Deben ser almacenados en refrigeración por no más de 24 horas, no debiendo ser congeladas.

TRANSPORTE DE MUESTRAS PARA SU ANALISIS Muestras destinadas a conteo de Vibrio sp., C. perfringens y bacterias lácticas: No deben ser congeladas, debido a la gran susceptibilidad de esos M’os al congelamiento.

TRANSPORTE DE MUESTRAS PARA SU ANALISIS Muestras de alimentos perecibles comercializados en forma congelada: Deben ser transportadas y mantenidas congeladas hasta el momento del análisis. No deben sufrir descongelamiento total o parcial durante el transporte. La temperatura de almacenamiento no debe ser superior a -10 ºC.

TRANSPORTE DE MUESTRAS PARA SU ANALISIS Transporte refrigerado de muestras perecibles refrigeradas o congeladas: Puede hacerse en cajas de tecnopor con hielo, éste debe estar en bolsas plásticas: Para evitar el acúmulo de líquido de la caja. Las cajas bien cerradas y con el hielo pueden mantenerse a Tº de refrigeración hasta por 24 – 30 hrs.

TRANSPORTE DE MUESTRAS PARA SU ANALISIS Transporte refrigerado de muestras perecibles refrigeradas o congeladas: Si el transporte fue prolongado, se puede utilizar hielo seco, cuidando que: Si el embalaje de la muestra fuera permeable a los gases o es quebradizo al frío, debe: Usarse un embalaje secundario para prevenir un posible contacto del CO2 con la muestra.

TRANSPORTE DE MUESTRAS PARA SU ANALISIS Transporte refrigerado de muestras perecibles refrigeradas o congeladas: 2. No se debe colocar hielo seco en contacto directo con las muestras que deben ser transportadas bajo refrigeración.

RECEPCIÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS No debe aceptarse cualquier muestra que tenga: El embalaje rasgado Picado, violado Con cuerpos extraños, o Cualquier otro tipo de defecto (muestras transportadas bajo condiciones inadecuadas.

RECEPCIÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS No tiene sentido hacer el test de esterilidad comercial: En muestras de alimentos cuyos embalajes fueran abiertas antes del análisis. No tiene sentido en analizar muestras de alimentos refrigerados o congelados: Que fueron transportados a Tº ambiente.

PREPARACIÓN DE MUESTRAS DE ALIMENTOS SÓLIDOS O LÍQUIDOS CONCENTRADOS Abertura de envases: Desinfectar el área externa con etanol 70% o con alcohol yodado. En caso de latas destinadas al test de esterilidad comercial: Lavar con agua y detergente, luego desinfectar con etanol de 70% o con alcohol yodado (4%).

PREPARACIÓN DE MUESTRAS DE ALIMENTOS SÓLIDOS O LÍQUIDOS CONCENTRADOS Abertura de envases: Observar y anotar cualquier anormalidad en los embalajes, así como en el contenido interno: Olor y/o apariencia extraña Presencia de cuerpos extraños, etc.

PREPARACIÓN DE MUESTRAS DE ALIMENTOS SÓLIDOS O LÍQUIDOS CONCENTRADOS Retirada de la unidad analítica La unidad analítica utilizada, en la mayoría de alimentos, es de 25 gramos. En la retirada de la unidad analítica, hay que tener los siguientes cuidados:

PREPARACIÓN DE MUESTRAS DE ALIMENTOS SÓLIDOS O LÍQUIDOS CONCENTRADOS Cuidados asépticos: La abertura de los envases, la retirada y pesada de la unidad analítica, deben ser hechas, preferente- En el interior de cámaras de flujo laminar. Si no hubiera, trabajar cerca de un mechero Bunsen, con llama azulada.

Cámara de Flujo Laminar Fuente: ceal.ulagos.cl/areas/microbiologia/galeria.html

RECEPCIÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS A. Cuidados asépticos: Instrumentos y utensilios usados en la abertura de los envases y en la retirada de las unidades analíticas: Deben ser esterilizados (autoclave u horno), o Sumergidos en etanol 70% y flameados en el momento del uso.

RECEPCIÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS B. Retirada de la unidad analítica de muestras de líquidos concentrados y de alimentos pastosos, molidos o en polvo: Antes de retirar la unidad analítica, las muestras deben ser revueltas con una espátula estéril. El intervalo entre la mezcla y la retirada de la unidad analítica no debe exceder los 15 minutos.

RECEPCIÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS C. Retirada de la unidad analítica de piezas de alimentos sólidos Se debe usar un cuchillo o tijera estéril para cortarlo en pedazos menores: Cortes de carne, salchichas, quesos duros, etc. En caso de piezas enteras, se recomienda remover una parte de la piel.

RECEPCIÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS D. Retirada de la unidad analítica de muestras heterogéneas. Ejemplos: Pasteles rellenos, tortas, sobremesas, platos listos para consumo. La unidad analítica debe contener porciones tomadas de cada una de las diferentes partes.

RECEPCIÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS D. Retirada de la unidad analítica de muestras heterogéneas. En el análisis de alimentos sospechosos en brotes de intoxicación alimentaria: Es recomendable tomar unidades analíticas separadas para su análisis por separado

RECEPCIÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS E. Retirada de la unidad analítica de alimentos congelados La retirada de la unidad analítica de muestras de alimentos congelados, debe ser hecho: Siempre que sea posible, sin descongelamiento previo.

RECEPCIÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS E. Retirada de la unidad analítica de alimentos congelados Cuando no fuera posible retirar la unidad analítica sin descongelar la muestra, el descongelamiento: Debe ser hecho en la nevera, siempre que sea posible, en el envase original. Generalmente 18 horas son suficientes para descongelar la mayoría de las muestras.

RECEPCIÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS E. Retirada de la unidad analítica de alimentos congelados Si un descongelamiento más rápido fuera requerido, Puede mantenerse la muestra a 20 – 25 ºC por 3 horas, Seguidas, de un máximo de 15 minutos a Tº más altas (no superior a 40 ºC.)

RECEPCIÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS Retirada de la unidad analítica de alimentos congelados Si es posible, se recomienda remover la unidad analítica antes del completo descongelamiento. En ningún caso las muestras deben alcanzar temperaturas superiores a 5 ºC, Antes del inicio de los análisis.

RECEPCIÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS Retirada de la unidad analítica de alimentos congelados Almacenamiento de la contra muestra: Para almacenar la contra muestra de alimentos congelados, No es recomendable recongelar, después del descongelamiento y retirada de la unidad analítica la porción no utilizada de muestra.

RECEPCIÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS Retirada de la unidad analítica de alimentos congelados Almacenamiento de la contra muestra: Porque hay pérdida de células por injuria o muerte Esto es importante en el caso de muestras destinadas a la detección o recuento de: Vibrio sp., C. perfringens y bacterias lácticas.

RECEPCIÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS Retirada de la unidad analítica de alimentos congelados En estos casos, se recomienda colectar separadamente la muestra y la contra muestra. Si no fuera posible, remover la contra muestra antes de descongelar la muestra para su análisis, Con ayuda del método de un taladro eléctrico.

RECEPCIÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS Retirada de la unidad analítica de muestras con cantidades menores del que es necesaria Si la cantidad de muestra para el análisis fuera menor que la unidad analítica requerida: Se debe someter a la mitad del análisis, reservando la otra mitad como contra muestra.

RECEPCIÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS G. Retirada de la unidad analítica para el análisis simultáneo de Salmonella Es necesaria una unidad analítica adicional (25 g), para cada uno de los M’os que se desea analizar.

RECEPCIÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS H. Retirada de la unidad analítica de muestra de moluscos con conchas Refregar las conchas con agua corriente tratada. Abrirlas con la ayuda de un cuchillo estéril. Colectar los M’os y el líquido que escurre del interior de las conchas en un frasco estéril tarado.

RECEPCIÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS H. Retirada de la unidad analítica de muestra de moluscos con conchas Se debe lavar las manos entre la abertura de una concha y otra: Con agua y jabón, seguida con etanol de 70%.

RECEPCIÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS I. Retirada de la unidad analítica de muestras de huevos con cáscara Retirar los huevos de la nevera y transferirlo a una estufa a 20 ºC., por un corto periodo de tiempo. En seguida pasar a la estufa de 25ºC, también por un corto periodo de tiempo. Enseguida transferir a temperatura ambiente

RECEPCIÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS Retirada de la unidad analítica de muestras de huevos con cáscara Estos cuidados permiten evitar el acúmulo de condensado en la cáscara fría, Que favorece la penetración de bacterias al interior

RECEPCIÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS I. Retirada de la unidad analítica de muestras de huevos con cáscara Lavar los huevos con agua y detergente (11ºC - 32ºC), luego drenar el exceso de líquido. Sumergir los huevos en etanol de 70% por 10 minutos y flamear.

RECEPCIÓN Y PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA SU ANÁLISIS Retirada de la unidad analítica de muestras de huevos con cáscara Quebrar la cáscara y verter el contenido en el interior de un frasco estéril. Si hubiera necesidad de remover el exceso de la clara adherida a la yema: Rodar delicadamente la yema en una toalla estéril.

Selección del diluyente y primera dilución de una unidad analítica Los diluyentes recomendados para el análisis de la mayoría de los alimentos, son: Agua peptonada 0,1% Agua peptonada salina Agua peptonada tamponada

Selección del diluyente y primera dilución de una unidad analítica Análisis de derivados de la leche Se recomienda la solución de citrato de sodio 2% Queso, leche en polvo de baja solubilidad, yogurt y otras leches fermentadas. Agua destilada estéril para: Leche en polvo de alta solubilidad, leche condensada, concentrada o evaporada.

Selección del diluyente y primera dilución de una unidad analítica Análisis de Salmonella u otros microorganismos por enriquecimiento Caldo de enriquecimiento Caldo de pre- enriquecimiento para Salmonella

Selección del diluyente y primera dilución de una unidad analítica Análisis de moluscos con concha (ostras, mejillones , mariscos) La primera dilución debe ser 1:1 y, en caso que no sea posible pipetear el material, diluir a 1:3.

Selección del diluyente y primera dilución de una unidad analítica Análisis de condimentos La unidad analítica es de 11 gramos, diluidas en 99 ml de diluyente. Análisis de espesantes La unidad analítica es de 5 a 12,5 gramos. Se recomienda una dilución inicial de 1:100, en función de la alta viscosidad del material.

Homogenización de unidad analítica con el diluyente Alimentos líquidos concentrados, molidos o en polvo Pueden ser homogenizados por agitación manual en el frasco Invirtiendo 25 veces en un arco de 30 cm, o en un “shaker” rotativo

Homogenización de unidad analítica con el diluyente Alimentos líquidos concentrados, molidos o en polvo Las muestras de condimentos en cáscara o raíz, por ejemplo, deben ser previamente molidas: 100 gramos, por 30 segundos a baja rotación.

Homogenización de unidad analítica con un diluyente Alimentos sólidos en piezas Como cortes de carne, quesos duros, chocolate en barra, etc. Pueden ser homogeneizados por trituración en el Stomacher: 8 000 a 15 000 rpm por 1-2 minutos. A veces es necesario pre-enfriar el diluyente en baño con hielo antes de la homogeneización.

Homogenización de unidad analítica con un diluyente Alimentos pastosos Ejemplos: extracto de tomate, dulce de guayaba, purés, quesos blandos, helados en pasta, etc. Homogeneizar en Stomacher: 30 a 60 segundos. Las muestras de mayonesa u otras coberturas similares para ensaladas: 2 minutos en Stomacher.

Homogenización de unidad analítica con un diluyente Alimentos pastosos Para el análisis de coliformes, E. coli, Salmonella, S. aureus, Listeria y Yersinia, deben ser tratados: Con una solución estéril de NaOH 1 N, en la cantidad necesaria para neutralizar la acidez.

Stomacher Fuente: www.biosci-intl.com/products/stomachr.htm

Homogenización de unidad analítica con un diluyente Espesantes En la homogeneización del espesante por agitación, el diluyente no debe ser adicionado al producto: Porque dificultará la dispersión. Pesar la unidad analítica en papel de aluminio estéril y adicionarla al diluyente, bajo constante agitación.

Homogenización de unidad analítica con un diluyente Espesantes Para promover la agitación, en este caso, es recomendable utilizar un agitador magnético: Esterilizando previamente la barra magnética. Opcionalmente esas muestras pueden ser homogeneizadas en Stomacher por 2 minutos.

Homogenización de unidad analítica con un diluyente Polvos de baja solubilidad Muestras de alimentos en polvo con baja solubilidad: Huevo en polvo, leche en polvo: Homogenizar con agitación con auxilio de agitador magnético, Adicionando el diluyente de a poco, bajo constante agitación.

Homogenización de unidad analítica con un diluyente Alimentos grasosos Para homogenizar alimentos sólidos con alto tenor de grasa (> 20%), como tocino ahumado: Utilizar el diluyente con 1% (peso/volumen) de Tergitol 7 aniónico, Tween 80 o Triton X-100. Para facilitar la emulsificación.

Homogenización de unidad analítica con un diluyente Alimentos grasosos La homogeneización se consigue con 1 a 2 min. en licuificador, con baja rotación (8 000 rpm). Esta forma de homogeneización también puede ser utilizada para muestras de: Mantequilla, margarina , grasas y similares.

Homogenización de unidad analítica con un diluyente Alimentos grasosos Alternativamente pueden ser homogeneizados: Por fusión en baño (40 ºC/15 minutos) Adición del diluyente a 40 ºC. Agitación y preparación de las diluciones seriadas rápidamente, antes que la suspensión se enfríe.

Intervalo entre la homogenización y el procedimiento del análisis El intervalo entre la homogenización de la unidad analítica y la preparación de las diluciones posteriores: No debe pasar de los 3 minutos.

Diluciones seriadas de la muestra homogenizada Para la preparación de la segunda dilución (10-2) Transferir asépticamente 1,0 ml para 90,0 ml de diluyente. Las diluciones subsiguientes son obtenidas de manera similar: Transfiriendo 1,0 ó 10,0 ml de la dilución anterior a 9,0 ó 90,0 ml de diluyente.

DILUYENTES MÁS UTILIZADOS AGUA DE PEPTONA AGUA DE PEPTONA SALINA PARA DILUCIONES AGUA DE PEPTONA PARA DILUCIONES CON 3% NaCl AGUA DE PEPTONA PARA DILUCIONES

DILUYENTES MÁS UTILIZADOS CALDO LACTOSA CON 1 % DE TERGITOL CALDO LACTOSADO AGUA DE PEPTONA TAMPONADA CON 0,22% DE TERGITOL 7 AGUA DE PEPTONA TAMPONADA AGUA DE PEPTONA ALCALINA

AGUA DE PEPTONA ALCALINA Fórmula: Peptona l0,0 g. Cloruro sódico 5,0 g. Agua destilada 1,0 litro pH 9,0 – 9,2

AGUA DE PEPTONA TAMPONADA Fórmula: Peptona 10,0 g. Cloruro sódico 5,0 g. Fosfato disódico, 12 H2O 9,0 g. Fosfato monopotásico 1,5 g. Agua destilada 1,0 litro pH 7,0 ± 0,1

AGUA DE PEPTONA TAMPONADA CON 0,22% DE TERGITOL 7 A un litro de agua de peptona tamponada añadir 2,2 ml de tergitol aniónico 7 (heptadecilsulfato). Esterilizar a 121 ºC durante 20 minutos.

CALDO LACTOSADO Fórmula: Extracto de carne 3,0 g. Peptona o polipeptona 5,0 g. Lactosa 5,0 g. Agua destilada 1,0 litro pH final 6,7 – 6,9

CALDO LACTOSA CON 1 % DE TERGITOL A un litro de caldo lactosado: Añadir 10 mI de tergitol aniónico 7 (heptadecilsulfato sódico). Esterilizar a 121°C durante 20 minutos.

AGUA DE PEPTONA PARA DILUCIONES CON 3% NaCl Fórmula: Peptona 10,0 g. NaCl 30,0 g. Agua destilada 1,0 litro pH 7,0 ± 0,1

AGUA DE PEPTONA SALINA PARA DILUCIONES Fórmula: Peptona 1,0 g. NaCl 8,5 g. Agua destilada 1,0 litro pH 7,0 ± 0,1

AGUA DE PEPTONA PARA DILUCIONES Fórmula: Peptona 1,0 g. Agua destilada 1,0 litro pH 7,0 ± 0,1

AGUA DE PEPTONA Fórmula: Peptona 10,0 g. Cloruro sódico 5,0 g. Agua destilada 1,0 litro pH 7,2 ± 0,1

Fórmula (concentración normal): SOLUCIÓN RINGER Fórmula (concentración normal): Cloruro sódico 9,0 g. Cloruro potásico 0,42 g. Cloruro cálcico (anhidro) 0,48 g. Bicarbonato sódico 0, 20 g. Agua destilada 1,0 litro pH 7,0

GRACIAS