Búsqueda de sustancias biológicamente activas: Consideraciones acerca de estrategias de “screening” y evaluación. Dr. Armando Rojas Rubio Escuela de Medicina, Universidad Católica del Maule

Principales modos de acción entre xenobióticos y sistemas biológicos.

Bases de un programa de búsqueda de sustancias biológicamente activas. Química Fisiología Fisiopatología Bioquímica Biología Molecular Biología Celular Farmacología

Farmacología reversa Fuente de diversidad química Moléculas dianas Screening Evaluar eficacia seguridad Optimizar estructura Genómica Proteómica Bioinformática Fisiología Fisiopatología Quimiotecas (*) Química combinatoria Screening Convencional Alto flujo, etc ADME Farmacología Toxicología preclínica SAR Fármaco (*) NIH 10-01-07, Anuncio la creación de la Librería de Pequeñas Moléculas para ser utilizadas en la Red de Librerías Moleculares para Centros de Screening. http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/

Proceso de descubrimiento Serendipidad Etnomedicina Screening convencional o de alto flujo No es necesario conocer la estructura del blanco. Diseño racional de fármacos Si es necesario conocer la estructura del blanco

Etapas en la estrategia de búsqueda Descubrimiento: Ideas Candidatos Desarrollo: Candidatos Fármacos Sistema de screening o tamizaje de actividades biológicas Sistema que permite la identificación de compuestos que presenten actividad sobre un blanco o función especifica, potenciando que se conviertan en candidatos a una evaluación que permita el desarrollo hacia aplicaciones clínicas.

Niveles del Screening Nivel Molecular Unión a receptores, actividad enzimática, etc,. Nivel Celular/Tisular Función celular / tisular. Nivel Órganos/Sistemas Visión integradora In vitro In vivo

La búsqueda de candidatos Identificación y validación del blanco Tamizaje (primario y secundario) Identificación de un líder potencial Partida con estudios SARs Generación de presuntos candidatos Síntesis Química Química Medicinal Definición del farmacoforo Optimización del candidato

La búsqueda de candidatos

Aspectos esenciales que tienen que ser considerados en cualquier estrategia de screening Necesidad en Medicina Evento de amenaza a la vida Evento autolimitado Disponibilidad de opción terapéutica Nivel de satisfacción Ventajas sobre competidores Mejor selectividad/potencia Enfoque novedoso Oportunidad comercial Mercado potencial (número de pacientes) Duración del tratamiento Aplicación en condición aguda o crónica

Sistemas de tamizaje Screening primario: Diseño simple Blanco terapéutico definido (*) Alta sensibilidad y especificidad Usualmente una dosis. Recomendable ensayos en formato homogéneo y miniaturización. Screening secundario Confirmar la especificad sobre el blanco a un mayor nivel de complejidad (Mayor costo) Usualmente ensayos heterogéneos Permitir evaluación de efecto umbral y relación dosis respuesta (mínimo 3 dosis).

Blancos en el tamizaje primario All drugs that are presently on the market are estimated to target less than 500 biomolecules, ranging from nucleic acids to enzymes, G-protein-coupled receptors (GPCRs) and ion channels1 (

Metodologías mas usadas en el screening primario Ensayos basados en salidas de tipo: Radioactividad Colorimetría Turbidimetría Fluorescencia Quimioluminiscencia Bioluminiscenceia

Los sistemas de tamizaje primario/secundario Bioquímico Celular Caracterización sist. enzimático Caracterización del blanco Titulación (Km; Kd; etc) Respuesta activación/inhibición Concentraciones Densidad celular Potencia (IC50/EC50)

Logística del sistema de screening Bioquímico Celular Protocolo detallado Disponibilidad (lotes múltiples ?) Banco de células Efecto de pases Estabilidad en el tiempo Estabilidad de la señal Seguridad COSTOS

Variabilidad y reproducibilidad en la ventana de señal del ensayo Bioquímico Celular Tolerancia solvente (DMSO *) Ventana de respuesta del ensayo (máxima, media, mínima) Curvas de IC50/EC50 de tres días consecutivos de inhibidores/activadores La mayoría de las líneas celulares no son afectadas por < 0.1% DMSO La mayoría de los ensayos enzimáticos in vitro son tolerantes a 1–5% DMSO

Niveles de dosis a evaluar en screening primario y secundario Dianas intracelulares Dianas superficie celular Garantizar la identificación de compuestos de baja potencia. Evaluar varios compuestos simultáneamente en cantidades equimolares British Journal of Pharmacology (2007) 152, 53–61

Optimización de un líder. Estudios tipo SARs y Q SARs Las actividades biológicas de un compuesto estan definidas por la estructura y propiedades químicas del compuesto Los estudios SARs QSARs se utilizan para evaluar como diferentes modificaciones o descriptores moleculares (hidrofobicidad, topología y conectividad molecular, distribución de cargas, polaridad , puentes de H, etc) condicionan una actividad biológica determinada. Definir la estructura del farmacoforo y predecir actividad biológica.

El riesgo que hay que minimizar Un elevado porcentaje de las moléculas que inician como candidatos fracasan al llegar a la fase clínica debido, entre otras cosas, a problemas farmacocinéticos. Necesidad de poder predecir el comportamiento farmacocinético en humanos en etapas cada vez más tempranas.

Predicción de ADMET. El uso de recursos informáticos Absorción Distribución Metabolismo Eliminación Toxicidad Disponibilidad de herramientas informáticas (Noraymet, ADMETOX, etc) que ayudan a realizar estas predicciones sobre la base de entradas de ensayos in vitro e in vivo. Solubilidad Permeabilidad Unión a proteínas plasmáticas Movimiento a través de transportadores Metabolismo por enzimas hepáticas (P450) Distribución tisular Citotoxicidad

Principales razones para la falla de un candidato. Ineficacia. Toxicidad. Fallas en la biodisponibilidad.

Candidato selectivo, potente y optimizado y ADMET apropiada. Estudios preclínicos

Estudios preclínicos: Por que son necesarios? Demostrar su efectividad farmacológica en modelos animales Demostrar que el candidato puede ser evaluado de forma segura en humanos. Parte indispensable de los requerimientos de las agencias regulatorias.

Evaluación de actividad farmacológica en animales: La utilidad de los modelos animales de enfermedad. A este nivel entran solamente candidatos con reconocida actividad en screening primario y secundario y favorable evaluación de ADME. MUY ALTO COSTO Modelos animales de enfermedad. Modelos farmacológicos clásicos vs modelos de animales transgénicos, knock out, knock down.

Estudios preclínicos de Toxicología. Necesarios para seguridad de dosis. Realizados conforme a protocolos estándares, aprobados por las agencias reguladoras. Realizados de acuerdo a las GLP correspondientes.

Genotoxicidad Objetivo Determinar el potencial mutagénico y su posible riesgo a humanos Ensayos in vitro: Mutaciones puntuales. (actividad mutagénica) Ensayo de Ames Linfoma ratón (TK gen) Ensayos in vivo: Aberraciones cromosómicas in vivo (actividad clastogénica) Análisis citogenético de medula ósea ratón. Ensayo de micronúcleos.

Toxicidad aguda ( Dosis única) Objetivo: Determinar la LD50, Máxima Dosis Tolerada (MTD) Nivel de NO Observación de Efectos (NOEL) Requerimientos de especies: Rata, ratón. Parámetros: Mortalidad, Necropsias, cambio de peso, observaciones clínicas.

Toxicidad Sub aguda. Objetivo: Determinar toxicidad después de dosis repetidas. Especies mas usadas: Rata y ratón. Parámetros: Mortalidad, Hallazgos clínicos, química orina, histología, cambio de peso.

Toxicidad Subcrónica/crónica. Objetivo: Toxicidad en esquema de cronicidad. Especies mas usadas: Rata y ratón. Parámetros: Mortalidad, patología, histología, cambios conductuales, observaciones clínicas, cambio de peso.

Carcinogenicidad. Objetivo: Evaluar el potencial tumorigénico en animales y el riesgo a humanos. Especies mas usadas Rata o ratón. Parámetros: Desarrollo de tumor, lesiones pre-neoplásicas, anatomía patológica. known properties of molecule not needed if disease is severely debilitating and no current therapy exists i.e. oncolytic agents

Descubrimiento y desarrollo de fármacos. Un largo y tortuoso camino En promedio, 1 de 10 000 compuestos tiene éxito en un sistema de búsqueda y posterior evaluación. Puede tomar entre 6 y 8 años. Altísimo costo: Centenares de millones USD.

¿Como afrontar el reto?

Papel de las Universidades en un programa de screening Aprovechar todas las potencialidades de cooperación y sinergia transversal propias de la vida universitaria Lograr la identificación de un candidato potente y específico. Realizar la correspondiente acciones en protección de la propiedad intelectual. Estrategia de alianza para la etapa de desarrollo con la industria . Alan S.Verkman J. Physiol Cell Physiol 286: c465-c474, 2004

Muchas gracias