Bouzas, Carnazolli, Gascue, Scotto

Presentación del tema: "Bouzas, Carnazolli, Gascue, Scotto"— Transcripción de la presentación:

1 Bouzas, Carnazolli, Gascue, Scotto
Prion Uptake in the Gut: Identification of the First Uptake and Replication Sites Bouzas, Carnazolli, Gascue, Scotto

2 Introducción

3 Observaciones PrPSc resistentes a desnaturalización
Adquisición vía oral Del SD invaden el SN Causante de patologías neurodegenerativas (enf. de la vaca loca, enf. de Creutzfeldt-Jakob)

4 Captación de PrPSc Superficie intestinal:
FAE: epitelio folicular asociado a placas de Peyer

5 Sitio de Replicación de PrPSc
- Transmisión de priones a centros germinales. Allí, células foliculares dendríticas (FDC) expresan PrPC Acumulación y replicación de PrPSc Se alcanza el umbral necesario para infectar nervios periféricos PrPSc a SNC

6 Objetivos Determinar si el transporte de priones es o no dependiente de células M

7 Ratones Materiales y métodos 129/Ola Background
Wild type (wt) y Prnp-/-. Misma edad y sexo.

8 Exposición al prión Materiales y métodos
ME7 scrapie prions: wt y Prnp-/- alimentados con homogenato de cerebro de ratones terminalmente afectados por el prión. Grupos control alimentados con homogenato de cerebro de ratones sanos.

9 Ratones Materiales y métodos
RML scrapie prions: wt y Prnp-/- alimentados (vía sonda) con homogenato de cerebro de ratones terminalmente afectados por el prión. Grupos control alimentados (vía sonda) con homogenato de cerebro de ratones sanos. Paralelamente, se infectan grupos similares de ratones mediante un procedimiento similar, pero con homogenato de Hamsters Sirios (SHa), infectados con el prión Sc237 scrapie. En este último caso, se trató previamente con proteinasa K.

10 Recolección de muestras
Materiales y métodos Recolección de muestras Los ratones fueron sacrificados en 0; 1; 2; 7; 14; 21 y 105 dpf (días post infección). Se extraen placas de Peyer, nódulos linfáticos mesentéricos y bazo. Se preparan cortes histológicos para IF (semi-finos) y crio-inmuno (ultra-finos).

11 Marcación indirecta (vs directa): anticuerpo primario, seguido de un anticuerpo secundario marcado con Alexa Fluor 488 (verde) o Texas red (rojo) Anticuerpos primarios: Endosomas:antiLAMP1 Macrófagos (antiferritina) vs DC (anti MCH II) Membranas basolaterales de FAE y enterocitos: antiA33 PrP: monoclonales anti-PrP 6H4, R2, y policlonal 1B3

12 Materiales y métodos

13 Materiales y métodos CRYO-INMUNOGOLD EM
Oro unido a diferentes proteínas que pueden ser usadas como detectores de Ag en reacciones de IMCQ. Entre estas proteínas esta la Proteina A: Se extrae la pared celular de Staphylococcus aureus, y tiene la propiedad de unirse muy fuertemente a la porción Fc de los Ac. Esta unión no es de tipo inmune.

14 Materiales y métodos CRYO-INMUNOGOLD EM
Fácilmente identificable en las organelas donde se encuentra el Ag por lo tanto permite su cuantificación. No interfiere con pigmentos o enzimas endógenas Reacción de alto contraste y sensibilidad. Ac primarios se usan en baja concentración. Para entrar en los tejidos, cuanto menos sea el tamaño, mejor. A veces cuando la concentración del Ag es pequeña, las partículas de oro pueden visualizarse con técnicas de precipitación con Plata. Partículas de oro útiles en microscopia electrónica por su elevada electrodensidad. Muy útiles también cortes histológicos ya que se detecta fácilmente cuando se depositan en los tejidos por su color rojo intenso.

15 Materiales y métodos Se usaron Ac PrP-específico (6H4) y fragmentos Fab de Ac (R2)  se conjugaron con partículas comerciales de oro muy pequeñas (0,8 nm). Esto sirve para permitir una mayor penetración en las cryo secciones y evitar artefactos causados por reacción cruzada con inmunoglobulinas endógenas en el tejido. Se realizaron reacciones de marcado en condiciones nativas; no se aplicó ningún método de recuperación Ag.

16 Materiales y métodos Para algunos experimentos de inmuno-marcación, tanto el anticuerpo primario o secundario, se detectaron a través de la proteína A-oro. Para otros se usó el kit R-GENT SE-EM (comercial) con plata. Para el marcado doble se utilizó oro ultrapequeño (mejorado con plata) conjugado con anticuerpos anti PrP. Seguido de incubación con el segundo anticuerpo primario que se detectó posteriormente por la proteína A-oro.

17 Materiales y métodos La inmunomarcación de las secciones se realizó como se describe Previamente. En resumen: Después de bloquear con un 1% de gelatina de pescado frío y 1% de albúmina de suero bovino durante 15 min, las secciones se incubaron con anticuerpo primario durante 60 min, se lavaron y se puente anticuerpos de conejo se aplicaron durante 30 minutos cuando necesario. Las secciones fueron incubadas con la proteína A-oro (15 nm) durante 20 min. Las especificidades de los anticuerpos fueron controlado por omisión del anticuerpo primario. Secciones marcadas fueron vistas con un microscopio electrónico Philips CM10 (FEI Company, Eindhoven, Países Bajos) a 80 kV.

18 Materiales y métodos Cuantificación:
Se llevó a cabo la cuantificación de la distribución de partículas de oro. Los datos se presentan como la media +/- 6 SD. Los datos se analizaron usando una prueba T y se consideraron significativos cuando las diferencias p < 0,05.

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