CAPÍTULO 3. MARCADORES DE DETERMINACIÓN DIRECTA

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1 CAPÍTULO 3. MARCADORES DE DETERMINACIÓN DIRECTA
Extracción y cuantificación de ADN. Enzimas de restricción. PCR. Secuenciación. RT-PCR. Micromatrices. RFLPs. VNTRs. Genes. Inserciones Alu. SNPs. ADN mitocondrial. VCNs. Indice

2 Bibliografía complementaria
Alfonso-Sánchez et al 2006 Sequence polymorphisms of the mtDNA control region in a human isolate: the Georgians from Swanetia J Hum Genet 51: (JAP1309) Altshuler D, Daly MJ, Lander ES. (2008) Genetic mapping in human disease. Science. 322(5903):881-8. Barbujani et al 1997 An apportionment of human DNA diversity. Proc Natl Acad Sci Usa 94: (JAP1305) García-Obregón et al 2006 Genetic Position of Valencia (Spain) in the Mediterranean Basin According to Alu Insertions American Journal of Human Biology 18: (JAP1093) Gagneux et al 1999 Mitochondrial sequences show diverse evolutionary histories of African hominoids Proc Natl Acad Sci 96: (JAP757) Gómez-Pérez, L., Alfonso-Sánchez, M.A., Pérez-Miranda, A.M., de Pancorbo, M.M., Peña, J.A., 2007, Utilidad de las inserciones Alu en los estudios de mestizaje, Antropo, 14, Gresham et al 2001 Origins and Divergence of the Roma (Gypsies) Am J Hum Genet 69: (JAP1308) Hamzi, K., Bellayou, H., Slassi, I., Nadifi, S., 2010, La maladie de Steinert dans une famille marocaine: phénomène d’anticipation et  conseil génétique. Antropo, 23, Kalaydjieva et al 2001 Genetic studies of the Roma (Gypsies): a review BMCMedical Genetics, 2:5 (JAP1307) Lovell et al 2005 Ethiopia: between Sub-Saharan Africa and Western Eurasia. Annals of Human Genetics. 69,275–287 Moffatt MF, et al., (2007) Genetic variants regulating ORMDL3 expression contribute to the risk of childhood asthma. Nature. 26;448(7152):470-3. Nei M, Takezaki N 1996 The Root of the Phylogenetic Tree of Human Populations Mol Biol Evol 13: (JAP1306) Pérez-Miranda A.M. Alfonso-Sánchez M.A. Vidales M.C. Calderón R. Peña J.A Genetic polymorphism and linkage disequilibrium of the HLA-DP region in Basques from Navarre (Spain) Tissue Antigens 64: 264–275 (JAP1025) Pérez-Miranda et al 2005 Microsatellite data support subpopulation structuring among Basques J Hum Genet 50: Redon et al 2006 Global variation in copy number in the human genome Nature 444: Reneland et al 2005 Association between a variation in the phosphodiesterase 4D gene and bone mineral density BMC Medical Genetics 2005, 6:9 Rodríguez-Ezpeleta N, et al 2010 Hum Genet. 128(1):113-7 Rosenberg et al 2002 Genetic Structure of Human Populations Science 298: (JAP1020) Sánchez-Mazas A 2001 African diversity from the HLA point of view: Influence of genetic drift, geography, linguistics, and natural selection Human Immunology 62: (JAP861) Seldin et al 2006 European Population Substructure: Clustering of Northern and Southern Populations PLoS Genet. 2(9): e143 (JAP1164)

3 Bibliografía complementaria
Tishkoff et al 2007 Convergent adaptation of human lactase persistence in Africa and Europe Nature Genetics, 9 Watkins et al 2003 Genetic Variation Among World Populations: Inferences From 100 Alu Insertion Polymorphisms Genome Research 13:1607–1618 (JAP1101) Zhivotovskyet al 2003 Features of Evolution and Expansion of Modern Humans, Inferred from Genomewide Microsatellite Markers Am. J. Hum. Genet. 72:1171–1186 (JAP1160)

4 Marcadores de determinación directa
Los grandes avances que han tenido lugar en las últimas décadas en numerosas técnicas de Biología molecular y sobre todo en las que tienen que ver con el análisis y la manipulación del ADN, han abierto las puertas a un nuevo tipo de estudios de polimorfismos, ya no sobre los productos de los genes, sino directamente sobre los genes mismos. La gran cantidad de polimorfismos encontrados entre los productos de expresión de los genes, como los grupos sanguíneos o las proteínas plasmáticas, es superada ampliamente por la variación genética en las moléculas de ADN. Hay una gran fracción del genoma que no aparece envuelta en la codificación de proteínas. Se compone de fragmentos de ADN situados entre los genes, con secuencias reguladoras, genes que han perdido su utilidad a lo largo de la evolución y ya no son transcritos, etc. Las mutaciones en las regiones no codificantes del ADN generalmente no producen un efecto fenotípico y se comportan como selectivamente neutrales. Por ello, pueden acumularse una tras otra sin ser eliminadas por selección, dando lugar a valores muy elevados de variabilidad y presumiblemente de heterogeneidad entre los individuos y las poblaciones. Desde el comienzo del Proyecto Genoma Humano, dedicado a la secuenciación de todo el ADN humano, se ha podido acceder al conocimiento de una gran variedad de polimorfismos, algunos de los cuales han sido o están siendo analizados en diferentes poblaciones. En general, han revelado una enorme variabilidad que es transmitida según la herencia mendeliana. Ha aparecido por tanto, un nuevo y vasto campo de investigación sobre marcadores genéticos. La clasificación de los polimorfismos de ADN podría realizarse de acuerdo a diferentes criterios. Podrían por ejemplo, desde el punto de vista funcional, dividirse entre ADN nuclear y ADN mitocondrial y dentro de cada grupo en ADN codificante y no codificante. Además, las técnicas de análisis avanzan continuamente, por lo cual diferentes estudios sobre el mismo fragmento de ADN no son siempre comparables. Por ello, primero se describirán las principales técnicas utilizadas para a continuación enumerar los tipos de polimorfismos que han sido analizados con una cierta frecuencia.

5 Extracción de ADN Puede obtenerse ADN de una gran cantidad de tejidos. Habitualmente se toman muestras de sangre total en tubo, de manchas de sangre en papel, de células bucales, de pelos o de hueso. Entre las varias técnicas disponibles, puede comenzarse con una solución de lisis (detergente y proteinasa K). El detergente rompe las membranas celulares y nucleares y libera el ADN. La proteinasa K rompe las histonas sobre las que se enrolla el ADN. Una sal concentrada ayudará a crear complejos con las proteinas y otros elementos de las células. Centrifugando a alta velocidad, éstos se depositarán en el fondo y quedará un sobrenadante con las cadenas de ADN.

6 Extracción de ADN Añadiendo isopropanol, se formarán grumos de ADN, ya que no es soluble en alcohol. Centrifugando nuevamente, quedará un precipitado de ADN. Entonces se puede eliminar el sobrenadante y disolver a la concentración adecuada. Una técnica alternativa que obtiene mejores resultados, es la que se basa en la aplicación de fenol, cloroformo y alcohol isoamílico, aunque algunos de los reactivos son altamente tóxicos. Otra técnica alternativa se basa en Chelex, una resina quelante que atrapa los iones de Magnesio, necesarios para la acción de las DNAsas. De este modo, el ADN de la muestra no se degrada y puede ser almacenado durante un tiempo. En sentido estricto no es una extracción, ya que no se depura el ADN.

7 Extracción de ADN También pueden utilizarse diferentes kits comerciales (basados en columnas de filtración, partículas metálicas, etc.) e incluso puede realizarse de forma automática. El ADN se conserva a -20ºC al menos, o mejor a -80ºC.

8 Cuantificación de ADN Puede evaluarse la calidad del ADN extraído de dos formas. Puede realizarse una electroforesis de agarosa con una pequeña parte de las muestras y evaluar por comparación la intensidad de la fluorescencia.

9 Cuantificación de ADN Fluorímetro
O bien, mediante un espectrofotómetro UV, que leerá la absorbancia a 260 y 280 nm, evaluando la proporción de ADN y proteinas de las muestras. Los ácidos nucleicos se revelan a 260 nm y las proteínas a 280. Una unidad de absorbancia (OD) equivale a unos 50 µg/ml de ADN de doble cadena, 40 µg/ml de ARN, 33 µg/ml de ADN de hebra sencilla y 30 µg/ml de oligos. La pureza se mide por la relación A260/A280 y debe ser aproximadamente 1,8 para ADN y 2 para ARN. Ambos métodos pueden considerarse complementarios.

10 Enzimas de restricción
Enzima Secuencia Enzima Secuencia Eco RI GAATTC Nar I GGCGCC Bcl I TGATCA Nae I GCCGGC Nco I CCATGG Sma I CCCGGG Bam HI GGATCC Acc III TCCGGA Alu I AGCT Taq I TCGA Hae III GGCC Mae II ACGT Apa I GGGCCC Mae I CTAG Not I GCGGCCGC Nde I CATATG Bal I TGGCCA Ssp I AATATT Hind III AAGCTT Spe I ACTAGT Cfo I GCGC Swa I ATTTAAAT Las enzimas de restricción tienen como característica principal que reconocen una determinada secuencia de nucleótidos en el ADN y cortan la cadena por ese punto. Algunas de las más de 100 conocidas en la actualidad aparecen en el cuadro adjunto. Puede observarse que las secuencias que reconocen son de una longitud variable, normalmente entre 4 y 8 nucleótidos. También puede apreciarse que en cada caso, la cadena complementaria es idéntica si se lee en sentido contrario. Esto permite que las cadenas cortadas puedan unirse de nuevo.

11 Enzimas de restricción
Esquema de un análisis básico con enzimas de restricción El uso clásico de las enzimas de restricción para el análisis de polimorfismos de ADN se esquematiza en la figura. Basicamente, se trata de cortar el ADN mediante las enzimas adecuadas. A continuación se separan los fragmentos obtenidos mediante electroforesis. Después, se transfieren a una membrana y se hibridan los fragmentos resultantes con una sonda marcada que permita su visualización. Este método consumía tradicionalmente una gran cantidad de ADN. En la actualidad, se aplican las enzimas sobre ADN amplificado, optimizándose el proceso.

12 Enzimas de restricción
La existencia de una mutación en un lugar de restricción impedirá que la enzima corte por ese punto, de modo que puede detectarse dicha mutación. En esta figura se detecta una mutación que define un nuevo genotipo. La banda que se obtiene en este caso es más larga y por tanto más pesada, lo que se detecta al realizar la electroforesis.

13 Enzimas de restricción
Siguiendo con el ejemplo anterior, los homocigotos para la mutación tendrán una sola banda más pesada, los homocigotos sin mutación tendrán las 2 bandas (intermedia y ligera) y los heterocigotos tendrán las 3 bandas.

14 Enzimas de restricción
Marcador Madre Hijo Marcador Padre alegado Mix Marcador Madre Hijo Padre alegado Mix Marcador Tests sencillos de paternidad

15 Reacción en cadena de la polimerasa
La reacción en cadena de la polimerasa (en inglés Polymerase Chain Reaction, PCR) es un método diseñado para amplificar ADN, de modo que se obtienen una gran cantidad de copias del fragmento del genoma que se pretenda estudiar. Merced a este proceso, la manipulación y el análisis del material hereditario resultan mucho más sencillos y eficaces. La enzima implicada es la Taq polimerasa, que tiene como particularidad ser efectiva a una elevada temperatura (72 ºC), de modo que puede controlarse de un modo relativamente sencillo el tiempo durante el cual está sintetizando nuevo ADN. Esta técnica se realiza en un aparato denominado termociclador, que utiliza una hebra de ADN como molde para sintetizar la cadena complementaria mediante la Taq polimerasa, de un modo muy similar a como ocurre en la propia célula. El termociclador somete a las muestras a una serie de cambios cíclicos de temperatura, que facilitan cada uno de los procesos implicados en la replicación del ADN. La PCR se realiza mediante termocicladores

16 Reacción en cadena de la polimerasa
Generalmente es preciso conocer la secuencia del fragmento que se quiere amplificar o al menos dos fragmentos que flanqueen la secuencia en ambos extremos. Con esta información, se pueden sintetizar dos cebadores (o primers, oligonucleótidos de no más de 30 nucleótidos de longitud) complementarios de dos secuencias situadas a ambos extremos de la cadena. Las secuencias se diseñan mediante herramientas informáticas que permiten comprobar si son secuencias únicas o se encuentran repetidas en otros lugares del genoma. Los cebadores se unirán específicamente a estas secuencias y le indicarán a la enzima por dónde debe comenzar a copiar el ADN. Como se observa en la figura, se obtiene algunas cadenas de un tamaño mayor del esperado.

17 Reacción en cadena de la polimerasa
Sin embargo, el número de cadenas indeseadas es mucho menor que el número de cadenas adecuadas.

18 Reacción en cadena de la polimerasa
En primer lugar, el ADN se desnaturaliza, es decir, se calienta a unos ºC, de modo que se rompen los enlaces por puentes de hidrógeno que unen ambas cadenas y se separan. A continuación se baja la temperatura hasta unos 48 a 72ºC (dependiendo de la secuencia del ADN y de los cebadores), facilitándose la hibridación de los cebadores con las cadenas de ADN. Un nuevo calentamiento del medio, esta vez hasta unos 72 ºC, permitirá que la Taq polimerasa realice una copia de cada hebra en la que se haya insertado un cebador. Repitiendo una serie de veces este ciclo de temperaturas, se obtendrán un número muy elevado de copias del fragmento de ADN situado entre ambos cebadores. Una electroforesis permitirá analizar el resultado de la amplificación. La ventaja de esta técnica para el análisis de diferentes polimorfismos estriba en que la cantidad de ADN necesario para realizar la prueba es muy pequeña, ya que se obtienen un gran número de copias a partir de un reducido número de hebras y la calidad del resultado de la electroforesis es mucho mejor. En realidad, se pueden realizar amplificaciones PCR a partir de una sóla célula, aunque el riesgo de contaminación de ADN foráneo es entonces muy alto.

19 Reacción en cadena de la polimerasa
Trabajo publicado en 2013 presentando la primera amplificación y secuenciación del ADN mitocondrial de un resto de años, extraído de la Sima de los huesos, en Atapuerca.

20 Secuenciación Lectura manual de una secuencia
El análisis más completo y directo del ADN es el análisis de la secuencia de bases nitrogenadas. Mediante la secuenciación pueden detectarse absolutamente todas las variaciones que puedan darse en un fragmento del genoma. Además, puede analizarse cualquier región, sea codificante o no. Existen varias técnicas, entre las que destacan el método de los dideoxinucleótidos o de Sanger, que ha sido tradicionalmente el más habitual. Se basa en la síntesis enzimática de ADN marcado mediante dideoxinucleótidos que terminan la síntesis de la cadena. Actualmente, se usan cada vez más métodos de secuenciación masiva.

21 Secuenciación El método de los dideoxinucleótidos se basa en la existencia de cuatro tubos de reacción PCR. En cada uno de ellos, una parte de una de las bases está marcada. Así, un tubo tendrá dideoxiadenina, otro dideoxicitosina, otro dideoxiguanina y otro dideoxitimina. Cada una de ellas además lleva adherido un fluorocromo diferente. Cuando en la síntesis de una nueva cadena por la polimerasa se inserta un dideoxinucleótido, la síntesis de esa cadena se detiene. Al finalizar los ciclos PCR, en cada tubo habrá tantas cadenas de longitud diferente como posiciones en las que se haya podido insertar el dideoxinucleótido.

22 Secuenciación Analizador de ADN
Aunque en ocasiones se han realizado secuenciaciones manuales, ahora se utilizan los analizadores de ADN, popularmente llamados secuenciadores automáticos.

23 Secuenciación Analizador de ADN
1 2 3 4 5 6 Analizador de ADN En un secuenciador de capilaridad, las muestras se desplazan desde el cátodo (1) hasta el ánodo (2) a lo largo de un capilar (3) para pasar a través del haz de un láser (4). Hay una gradilla con muestras al principio del recorrido (5) y un émbolo que inyecta polímero entre cada muestra para limpiar y rellenar el capilar (6).

24 Secuenciación El resultado es un electroferograma como el de la figura.

25 Secuenciación NGS En los últimos años se están desarrollando nuevos métodos, más eficaces de secuenciar el ADN. Se denominan genéricamente como Next Generation Sequencing (NGS). Generalmente se basan en la rotura del ADN en multitud de pequeños fragmentos que son fijados a algún soporte sólido. Varios ejemplos: a) Una molécula de ADN se une a una microesfera y se pone en contacto con los reactivos adecuados en un microrreactor (una especie de burbuja) en una emulsión. b) Sobre un soporte sólido se fijan las moléculas de ADN y los cebadores, c) sólo los cebadores, d) o sólo las moléculas de ADN. e) También puede fijarse la polimerasa.

26 Secuenciación NGS Los fragmentos de ADN son entonces secuenciados simultáneamente. Después se reconstruye la secuencia completa a partir de los solapamientos de las diferentes cadenas.

27 Secuenciación NGS Uno de los métodos basados en emulsiones es la pirosecuenciación. En el esquema de la izquierda se muestran los pocillos donde se disponen los fragmentos de ADN unidos a microesferas, con el objeto de facilitar el acceso de las enzimas implicadas. En la pirosecuenciación se van añadiendo sucesivamente soluciones de A, C, G y T. A medida que se polimeriza la nueva cadena un conjunto de 3 enzimas (sulfurilasa, luciferasa y apirasa) transforma los pirofosfatos liberados por la unión de un nucleótido en emisión de fotones. Si se encuentran dos nucleótidos iguales seguidos, la emisión en la ronda de ese dNTP será el doble. La imagen que se obtiene se denomina flujograma.

28 Secuenciación NGS Entre los ejemplos de soporte sólido, en la figura se observa el método de los terminadores reversibles. El ADN se encuentra fijado junto al cebador en la placa, con un terminador reversible 3'-O-azidometil. Se añade una solución de dNTPs, cada uno marcado con un fluorocromo diferente. Se lava para eliminar los sobrantes y se lee la emisión en cada punto de la placa. Entonces se regenera el grupo 3'-OH del terminador usando un agente reductor y se repite el proceso.

29 Secuenciación NGS

30 PCR cuantitativa La PCR cuantitativa o PCR a tiempo real es una modificación de la técnica original que permite conocer la existencia de amplificación y el número de copias obtenidas conforme se desarrolla el proceso. La PCR a tiempo real combina un termociclador, un espectrofotómetro y un ordenador.

31 PCR cuantitativa El termociclador efectúa la PCR sobre unas muestras a las que añade un fluorocromo en cada amplificación si ésta se realiza. El espectrofotómetro detecta la emisión del fluorocromo y lo transmite al ordenador. Puede conocerse en qué pocillos ha habido amplificación y la intensidad de la misma.

32 PCR cuantitativa PCR cuantitativa con Fusión de Alta Resolución
(High Resolution Melt, HRM) En la modalidad HRM, se ha añadido un fluorocromo que solo emite fluorescencia cuando se encuentra en una doble hebra de ADN. Después de la amplificación, se desnaturaliza la muestra de ADN subiendo la temperatura gradualmente desde 55 hasta 95ºC. Cuando se separan las 2 hebras, deja de emitir fluorescencia. Pero la velocidad con que esto ocurre depende de la secuencia de nucleótidos, de modo que una mutación alterará la curva de disminución de la fluorescencia.

33 Micromatrices Las micromatrices son soportes de cristal, silicio o plástico en las que se fijan miles de sondas específicas de secuencia conocida con fluorescencia. Al poner una muestra en contacto con las sondas, aquellas cadenas que tienen una secuencia complementaria se hibridan. A continuación se eliminan todas las cadenas que no se han unido mediante lavados. Después se analiza la imagen obtenida para obtener un patrón de intensidades en cada casilla. Es una actualización del clásico método Southern blot.

34 Micromatrices Tradicionalmente se han usado para el análisis de la expresión génica. Pero también son útiles para el genotipado de variantes polimórficas de SNPs.