Es una técnica diseñada para amplificar una región específica de DNA. Al producto final obtenido de la amplificación se lo denomina Amplicón. PCR: Polymerase.

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1 Es una técnica diseñada para amplificar una región específica de DNA. Al producto final obtenido de la amplificación se lo denomina Amplicón. PCR: Polymerase Chain Reaction (Reacción en cadena de la Polimerasa) Ventajas de la PCR Velocidad (2 a 4 horas, dependiendo del tamaño a amplificar). Facilidad de uso. Sensibilidad (es necesario muy poco DNA). No es necesaria una alta pureza del DNA (ej. Colony PCR). Desventajas de la PCR Información de secuencia a amplificar (en general). Tamaño de amplificación limitado (25 kb en casos especiales). Al ser tan sensible debe tenerse cuidado con posibles contaminaciones.

2 Requerimientos para una PCR En la reacción Muestra (templado o molde: DNA o cDNA) Primers DNA polymerasa resistente a alta temperatura Mg ++ Deoxynucleótidos trifosfatos – dNTPs (dATP, dGTP,dCTP, dTTP) Buffer, KCl Termociclador – instrumento programado para cambiar la temperatura de las muestras rápidamente desde una temperatura a otra.

3 En detalle Templado o molde - ADN Simple o doble cadena - Los templados circulares son amplificados con menos eficiencia de los lineales. - El tamaño del molde no es crítico. - Muy poca cantidad (1  g de ADN humano, 10 ng ADN de levadura, 1 ng de ADN bacteriano o 1 pg de ADN plasmídico) - No necesariamente puro, pero libre de altas concentraciones de EDTA o cationes que pueden actuar como quelantes. Es importante que el molde no compita con los primers en el annealing, que puede ocurrir por excesiva cantidad de templado inicial, afectando la fidelidad del producto.

4 Primers Deben: tener una longitud de entre 18 y 25 nt. tener un contenido de G+C entre 40-60% ser complementarios a hebras opuestas en el templado. Primer forward (fw) o sense (se) Primer reverse (rev) o antisense (as)

5 5´ 3´ Deben evitar ser complementarios entre si y con su par de amplificación (no formar dímeros de primers, especialmente en el 3´). Primers (cont.) 5´ 3´ PCR Dímero de primer

6 Primers (cont.) Deben evitar formar estructuras secundarias (especialmente el 3´). 5´ 3´ 5´ 3´ PCR

7 Primers (cont.) Tm similares, entre 55 y 75 ºC. Tm = 2(A + T) + 4(G + C) ºC presentes en exceso (0.1 – 1.0  M cada uno) para favorecer el annealing entre el molde y el primer. en general se busca que tengan una C o G en el 3´, el 5´no importa tanto en el apareamiento (pueden llevar sitios de corte para enzimas de restricción o colas largas). 50 %

8 Dna polimerasa termo-resistente Taq DNA polymerasa: Aislada de Thermus aquaticus (vive en aguas termales). No tiene proofreading: comete un error cada 10.000 nt Deja extremos de A en el 3´ (permite clonado desde la PCR). Pfu DNA polymerasa: Aislada de Pyrococcus furiosus (también vive en aguas termales). Posee proofreading: 3´-5´exonucleasa (comete un error cada 50.000.000 nt). Deja extremos romos. 1-2 unidades de enzima /50  l de reacción Características principales a considerar al elegir la enzima: Procesividad Fidelidad

9 Mg ++ es un cofactor de DNA polimerasas Determinar la [Mg ++ ] óptima es uno de los pasos más importantes en la puesta a punto de una PCR. Muy poco – la polimerasa no funciona correctamente, afectando el rendimiento de la reacción Mucho – favorece el annealing de los primers a lugares que no son 100 % complementarios, afectando la especificidad y el rendimiento de la reacción Mg ++ (MgCl 2, MgSO 4 )

10 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Deben estar presentes en cantidad suficiente para que se logre la extensión a lo largo de todos los ciclos (~200  M cada dNTP). Se afecta el rendimiento de la reacción. No deben estar en exceso para que los iones Mg ++ no estén formando complejos con los dNTPs y no disponibles como cofactores para la enzima. Se afecta el rendimiento de la reacción y la fidelidad del producto final.

11 El buffer es en general Tris base ajustado a un pH específico con HCl. pH 8.3 es el óptimo para Taq. El pH óptimo mantiene la enzima plegada en una conformación a la cual es enzimáticamente activa. KCl: contribuye al plegamiento correcto de la enzima. Buffer

12 Etapas en una PCR Hay 3 etapas básicas en una PCR 1. Desnaturalización del DNA (~ 94º C) por 1 min. 2. Apareamiento (Annealing) (Tm primers – 5º C) por 30 seg. 3. Extensión (72º C) 1 min/kb a amplificar. 1 2 3 Generalmente se agrega un paso inicial a 94º C por 1 a 5 minutos, y un paso final a 72º C por 5-10 minutos. 1- 5 min a 94º 1 min a 94º 30 seg a Tm – 5º 1 min/kb a 72º 10 min a 72º x 35 ciclos

13 1º ciclo 2 moléculas DNA doble cadena 2º ciclo 4 moléculas DNA doble cadena 3º ciclo 8 moléculas DNA doble cadena Amplificación exponencial 2 n copias donde n es el número de ciclos de PCR Para 30 ciclos = 1,073,741,824 copias Asumiendo que se empieza con una sola molécula de molde, pero en general se usan cientos o miles (calculen). ¿Cuántas copias se pueden sintetizar?

14 En realidad esto no es tan así ciclos DNA amplificado Al final de la PCR se llega a un “plateau”. La enzima va perdiendo actividad.

15 Controles de PCR Control Sin templado: no debe haber producto; de no ser así hay DNA contaminante en algún reactivo, o no hubo cuidado al pipetear. Control positivo (si lo hay): debería haber producto, muestra que todos los reactivos funcionan y como debería verse el producto. Control de primers: se usa molde pero se agrega uno u otro primer (se hace para los dos). Muestra que no haya amplificación con solo uno de los primers. Si hay, el primer se une a lugares no específicos.

16 Como se prepara una PCR? Para una misma reacción, con solo uno de los reactivos que cambia, se hace una “Mix”. Ejemplo para una PCR de 20 tubos (de 20  l vol final) donde solo varía el molde: Buffer (10x) 2  l 42  l Mg++ (50mM) 0.6  l 12,6  l dNTPs (10mM) 0.4  l 8,4  l Primer 1(100ng/  l) 0.4  l 8,4  l Primer 2 (100ng/  l) 0.4  l 8,4  l Taq (1U/  l) 1  l 21  l Molde 1  l - H2O 14,2  l 298,2  l 1X 21X Se prepara la mix en un tubo, se alicuota en los tubos de reacción, y luego se agrega el molde. Mix = cantidad de cada uno de los reactivos por PCR X (# de PCRs) +1

17 Como se prepara una PCR? En general siempre se agrega lo menos costoso primero (en este caso el agua) Por lo general siempre se agrega el molde al final, de manera de evitar la contaminación y que la enzima pueda empezar a amplificar. En el laboratorio deben usarse pipetas destinadas a PCR, tips con filtro y lugares distintos para el agregado de reactivos y templados.

18 Variaciones de PCR Hot Start PCR: Para evitar amplificación inespecífica. Hay enzimas polimerasas que tienen un anticuerpo unido que les impide amplificar hasta que se desnaturaliza en la primer etapa de la reacción Heminested PCR: Se usa un solo primer nuevo que aparea más internamente en pareja con uno de los primeros primers usados, y el producto de la primera PCR como molde. Nested PCR: Para incrementar la especificidad del producto de amplificación se puede usar un segundo par de primers que aparean más internamente que los primeros, y realizar una segunda PCR usando el producto de la primera PCR como molde.

19 Variaciones de PCR RT-PCR: PCR sobre producto de Transcriptasa Reversa En general se usa para detectar mRNAs específicos, conocer secuencias nuevas de RNA, amplificar cDNAs que provienen de cantidades mínimas de RNA (y cuantificarlos), clonar ORFs eucarióticos, etc.

20 Aplicaciones de PCR Rastreo de clones Clonado por PCR Mutagénesis dirigida Diagnóstico de enfermedades Detección de organismos infecciosos Medicina forense y determinación de paternidad; Fingerprinting (AFLPs, RAPD) Cuantificación de mRNA y DNA (PCR en Tiempo Real)

21 Trabajo Práctico PCR Objetivo: Aplicar la técnica de PCR al rastreo de clones utilizando la variante de Colony PCR Colonias sobrevivientes de la selección MIX 1 4 32 1 5 3245 Inocular cultivos de LB + ampicilina Tubos de reacción de PCR Picar colonias al azar 1.Termociclador 2.Análisis de productos en gel de agarosa con bromuro de etidio Incubar ON a 37ºC y agitación

22 Armado de la mix de reacción Controles: - Control negativo de amplificación - Control negativo de contaminación - Control positivo VOLUMEN FINAL EN CADA TUBO 20  L

23 Condiciones de la PCR Primer pGex_s: 5´ GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG 3´ Tm: _ºC Primer pGex_a: 5´ CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG 3´ Tm: _ºC 94ºC3min 94ºC30seg _ºC30seg 72ºC_ seg 72ºC5min x35 Tamaño del amplicón: 860 pb