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Publicada porCésar Livas Modificado hace 9 años
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MUERTE CELULAR APOPTÓTICA IN VITRO DURANTE LA DIFERENCIACIÓN ERITROIDE
Zamai et al. Apoptosis 9: , 2004
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ERITROPOYESIS Stem cells células eritroides tempranas y tardías eritrocitos Diferenciación eritroide: - sensibilidad a EPO - Glicoforina A - CD45 - cambios nucleares - pérdida organelas - síntesis Hb
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ANTECEDENTES Médula ósea normal eritroblastos apoptóticos Eritroblastos inmaduros receptores de muerte (Fas, TRAIL-R1 y TRAIL-R2) Eritroblastos maduros, macrófagos y células NK inmaduras ligandos FasL y TRAIL Homeostasis balance EPO vs. TRAIL y FasL
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OBJETIVO Caracterizar la muerte de células eritroides que ocurre in vitro MÉTODOS Sangre células mononucleares CD34+ cultivo en medio sin suero (+ SCF + EPO + IL-3) Diferenciación unilinaje población homogénea de células
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CITOMETRIA DE FLUJO Ag de membrana (CD34, CD45, Glicoforina A) - Ag intracelulares (HbA y HbF) Características apoptóticas / Ciclo celular: Anexina-V Coloración supravital con IP FSC – SSC EtOH permeabilización + IP
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Microscopía electrónica de transmisión (TEM) características ultraestructurales
Electroforesis de ADN (ladder) fragmentación del ADN Microscopía de fluorescencia TUNEL marcación de 0H 3’ (dUTP-FITC)
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CITOMETRIA DE FLUJO: (seguimiento de la diferenciación)
Gli+ (low-int) % Gli+ (intenso) FSC SSC % Gli+ (intenso) FSC SSC (tamaño) (complejidad)
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Citometría de flujo: detección de HbF y HbA
Tinción con bencidina 20-25% Citometría de flujo: detección de HbF y HbA 80%
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Microscopía electrónica de transmisión de células eritroides
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Citometría de flujo: expresión de CD45
Tinción con May-Grünwald-Giensa R1 = eritroide R2 = mieloide temprana + blastos R3 = mieloide tardía + neutrófilos R4 = monocitos R5 = células muertas
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CITOMETRIA DE FLUJO: Glicoforina A vs. Anexina-V-FITC
Gli débil/Anx-V+ Gli neg / Anx-V+ Gli débil/Anx-V+ Gli débil/Anx-V+
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Microscopía electrónica de transmisión de células apoptóticas
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Citometría de flujo: ciclo celular
Ladder de ADN
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Microscopía de fluorescencia: Reacción TUNEL
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DISCUSIÓN Diferenciación asociada con apoptosis
Células eritroides tienen particular tendencia a apoptosis (característica intrínseca?) Progenitores eritroides con distinta sensitividad a EPO
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DIFERENCIACIÓN ERITROIDE
Glicoforina A Hemoglobina adulta Tamaño Complejidad Material granular Hemoglobina APOPTOSIS Anx-V+ Alteraciones nucleares Pico subdiploide Fragmentación ADN Hipótesis: apoptosis se induce en el estadio del eritroblasto basófilo
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CONCLUSIÓN El incremento paralelo de células apoptóticas y células eritroides maduras, sugiere que la interacción entre eritroblastos inmaduros y maduros (donde los últimos pueden ejercer una actividad citotóxica sobre los primeros) contribuye a inducir apoptosis durante la diferenciación eritroide in vitro. Este proceso podría representar una reproducción del feedback regulatorio negativo observado en las islas eritroblásticas de la médula ósea.
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