EJEMPLO DE APLICACIÒN DEL PROCEDIMIENTO Se tiene una muestra de sangre, y se requiere determinar alcohol etílico por cromatografía de gas con headspace.

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2 EJEMPLO DE APLICACIÒN DEL PROCEDIMIENTO Se tiene una muestra de sangre, y se requiere determinar alcohol etílico por cromatografía de gas con headspace. Se determina que el rango de interés entre 0.2g/dL y 0.4g/dL. Como estandar interno se utilizará Isopropanol

3 Inicio Optimización ¿? (Requisitos) Planificación del Diseño Prediseño Pruebas Previas Validación Especificaciones de Conformidad Fin Optimización Flujograma de procedimiento

4 EJEMPLO DE APLICACIÒN DEL PROCEDIMIENTO  Requisitos: Legales: determinar en un rango de interés toxicológico y médico legal Mínimo de interés médico legal: 0.20g/dl Máximo: Dosis letal: 0.40g/dL Del cliente: Análisis rápido y exacto Que se requiere poca cantidad de muestra Que pueda aplicarse a sangre completa o hemolizada Técnicos: Sensibilidad y límite de detección que abarque el rango de trabajo Alto porcentaje de recuperación Que se requiera el mínimo de recursos y que sean accesible al laboratorio Que se pueda minimizar el tiempo de análisis utilizando lotes analíticos La menor cantidad de pasos de pretratamiento de muestra

5 EJEMPLO DE APLICACIÒN DEL PROCEDIMIENTO  Protocolo: Se define el protocolo según el formato del procedimiento Plan  Las actividades del proyecto  Período de tiempo de ejecución  Indicador de verificación, y controles para cada actividad  Responsables y asignaciones para cada actividad  Recursos de equipo y sus software, materiales, reactivos, software para procesamiento de datos ActividadPeríodoIndicador Respon sable recursos Pruebas previas 2 semanas Curva preelimi nar de calibrac ión Juan Cromatógrafo de gas reactivos

6 EJEMPLO DE APLICACIÒN DEL PROCEDIMIENTO  Pruebas de prediseño Se prepara una solución de patrón de Etanol y SI en agua destilada al 0.40 g/100mL Se prepara una segunda solución a 0.20g/ 100mL (50% de la solución 1) Se prepara una tercera solución al 0.10g/mL El blanco es agua destilada Se procesan las muestras y se registras las relaciones de áreas

7 EJEMPLO DE APLICACIÒN DEL PROCEDIMIENTO Nivel Área Etanol Área Estándar interno Relación de áreas 0,00 (blanco) 0,10 0,20 0,40

8 Pruebas previas  Identifique la concentración máxima de interés como C (puede basarse en la prueba A.1.1)  Prepare una solución del patrón, en una concentración equivalente al 9 % C (0.09C) y otra del 90 % de C ( 0.9C)  Prepare 10 réplicas del blanco, 10 réplicas de la concentración baja ( 0.09C) y 10 réplicas de la concentración alta (0.9C)  Efectúe el ensayo a las réplicas por el procedimiento en prueba  Registre en una tabla los datos de las concentraciones y la respectiva señal  Grafique los datos anteriores  Calcule la ecuación correspondiente para la recta  Calcule para cada concentración la exactitud y la precisión  Evalúe la exactitud y la precisión según los parámetros predefinidos EJEMPLO DE APLICACIÒN DEL PROCEDIMIENTO

9 Pruebas previas: Adicione a las muestras M1 y M2 cantidades del analito (A) en las concentraciones equivalentes a 0.4C y 0.7C, respectivamente así: M1 + A1 = 0.4C M2 + A2 = 0.7C (C es la concentración máxima de interés) Prepare un lote de soluciones, que constituido de la siguiente forma: 2 Blancos denominados BK1 y BK2 ( soluciones sin analito) 1 patrón de concentración 0.9C 1 patrón de concentración 0.09C 1 Muestra M1 1 Muestra M2 1 Muestra M1 + adición 0.4C 1 Muestra M2 + adición 0.7 C Efectúe el ensayo por el procedimiento en prueba Grafique Los datos obtenidos de la señal y la concentración Determine la ecuación, por el mismo procedimiento que anterior Compare la pendiente obtenida con la del experimento anterior Si son similares, se dice que el procedimiento analítico no presenta interferencia por matriz, es decir que el analito se comporta de la misma forma en la matriz de interés que en la solución acuosa.

10 EJEMPLO DE APLICACIÒN DEL PROCEDIMIENTO Optimización  Identifique posibles factores que pudieran influir en los resultados ( Estos deben quedar claramente identificados en el protocolo del método): Temp de columna, Presión de gas de arrastre y el flujo del gas  Varíe cada factor, estableciendo dos o más niveles para cada uno, pero todos los factores deben tener el mismo número de nivel.  Calcule el número de experimentos aplicando la formula.  nx donde n = número de niveles y x = número de factores  Elabore las posibles combinaciones de los factores  Realice los experimentos propuestos. Procesando para cada combinación tres réplicas y un blanco  Se evalúan cada una en base a los criterios predefinidos y se elige el sistema que se considere más conveniente

11 EJEMPLO DE APLICACIÒN DEL PROCEDIMIENTO

12 Validación:  1 Prepare  a) Un lote, para cada matriz estipulada, de 10 réplicas para cada 5 niveles de concentración dentro del rango establecido para el ensayo[1], y el respectivo blanco. [1]  M + Ai = Ci  Donde:  M: Cantidad constante de matriz para cada nivel de concentración  Ai: Es la cantidad de analito requerida para cada nivel de concentración  Ci: Es el nivel de concentración  b) Un lote de 10 réplicas para 5 niveles de concentración dentro del rango establecido para el ensayo, y el respectivo blanco, de soluciones patrón sin matriz  c) Un lote, para cada matriz estipulada, de 10 réplicas para cada 5 niveles de concentración dentro del rango establecido para el ensayo, y el respectivo blanco con sustancias que sean posible interferentes, cuando aplique

13 EJEMPLO DE APLICACIÒN DEL PROCEDIMIENTO  Procese los lotes de las muestras enriquecidas según el procedimiento estipulado y los lotes de solución patrón sométalos al ensayo directamente  Reproduzca los mismos lotes experimentales al menos 2 veces más, en días diferentes y analistas diferentes  Tabule los datos resultantes de manera adecuada  Calcule los atributos que correspondan Métodos cuantitativos Métodos cuantitativos El nivel más bajo puede corresponder al límite de la especificación del analito

14 EJEMPLO DE APLICACIÒN DEL PROCEDIMIENTO Resultados y especificaciones: Método de muestras enriquecidas Recuperación: 90% Exactitud del sistema: 99,98% Repetibilidad: CV = 1,55% Reproducibilidad: CV = 2,2% Límite de detección: 0.01g/100mL (g/dL) Límite de cuantificación: 0.03g/100mL (g/dL) Linealidad: mX + b = 0.9820X + 0.00123 r 2 = 0.9987 Especificidad y selectividad: Resolución con respecto a otros componentes: Etanol Tr = 2.4 tr metanol = 1.2, tr acetona = 2.0, tr acetaldehído..) Incertidumbre aproximada: +/- 0,001