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CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC). La fase móvil es líquida Partición o reparto Adsorción Intercambio iónico Exclusión molecular Cromatografía.

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1 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC)

2 La fase móvil es líquida Partición o reparto Adsorción Intercambio iónico Exclusión molecular Cromatografía líquida de alta eficiencia

3 Características y ventajas Trabaja con partículas muy pequeñas (< 10 m) Presiones de psi (pounds square inch = libras por pulgada cuadrada, 1 atm = psi/14.7) Rápida Picos angostos (alta eficiencia) Separa compuestos no-volátiles o térmicamente inestables Cromatografía líquida de alta eficiencia

4 BOMBA INYECTOR CÁMARA DE MEZCLA PRE-COLUMNA DETECTOR COLUMNA Esquema del equipo de HPLC

5 Elución con gradiente Elución isocrática Elución isocrática vs elución con gradiente Elución isocrática: solvente de composición constante. Elución con gradiente: solventes de distinta polaridad. Se varía la composición de la FM en forma continua o escalonada.

6 Solventes utilizados como FM Solventes orgánicos, agua/solventes miscibles, agua/soluciones reguladoras Alta pureza Desgasificados Tratamiento con He Sistema de desgasificación al vacío Filtración

7 Sistemas de bombeo Requerimientos Generación de altas presiones ( psi) Flujo libre de pulsaciones Caudales 0.1 – 10 mL/min Componentes resistentes a la corrosión (acero inoxidable, teflón)

8 Bomba recíproca o de movimiento alternado etapa de aspiración pistón fase móvil etapa de descarga hacia la columna Ventajas: pequeño volumen interno, resiste presiones > a psi, permite elución con gradiente, caudales constantes e independientes de la contrapresión de la columna y la viscosidad del solvente Desventaja: produce flujo pulsado (amortiguar)

9 Sistemas de inyección de muestra eluyente Llenado del bucle Inyección de muestra en columna columna eluyente columna muestra

10 Sistemas de inyección de muestra

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12 Composición similar a la columna cromatográfica Elimina materia en suspensión y componentes de la muestra que se unen irreversiblemente a la FE Se usa para mejorar la vida de la columna. Se reemplaza cuando se contamina. Precolumna

13 Tubos de acero inoxidable. Ocasionalmente de vidrio resistente Rectas ( cm de longitud) y 4-10 mm d.i. Tamaño partículas de relleno: 5–10 m Columnas termostatizadas: en general se trabaja a T ambiente. La T constante mejora el cromatograma Columna

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15 Rellenos Relleno pelicular. Esferas de vidrio o polímero no porosas de 30 – 40 m de diámetro. En la superficie de las esferas se deposita una capa delgada y porosa de sílica, alúmina, polímero. Relleno de partículas. Micropartículas porosas de sílica, alúmina o polímero de 3 – 10 m de diámetro. Se recubren con películas orgánicas que unen químicamente o físicamente a la superficie. Columna

16 Basados en la medida de una propiedad del eluyente (índice de refracción, constante dieléctrica, densidad) Basados en la medida de una propiedad del soluto (absorbancia, fluorescencia, corriente límite) Requisitos Sensibilidad adecuada Respuesta lineal amplia Respuesta rápida y reproducible Manejo sencillo Detectores

17 Celda del detector UV-visible en HPLC De la columna DetectorFuente UV Al desecho Ventanas de cuarzo

18 Ensanchamiento extracolumna Eficiencia de la columna Tamaño partículas de empaque Tamaño de muestra

19 10 m 5 m 3 m H (cm/min) H vs para partículas de diferentes diámetros

20 Tamaño de muestra adsorción L-L (k = 2.3) fase ligada (k = 4.3) fase ligada (k = 1.2) H g muestra/ g empaque De acuerdo al tipo de FE el efecto es más o menos pronunciado

21 Ensanchamiento extracolumna r 2 24 D M H ex = Se origina en los tubos que conectan los componentes del sistema cromatográfico (puerto de inyección y columna, columna y detector, etc.) coeficiente de difusión del soluto en fase móvil [cm 2 /s] radio del tubo [cm] velocidad lineal de FM [cm/s]

22 CROMATOGRAFÍA GASEOSA

23 G-L y G-FL G-S adsorción partición G-L Gaseosa líquida sólida FM FE MÉTODO INTERACCIÓN Cromatografía gaseosa

24 Ventajas: Alta resolución Alta velocidad Alta sensibilidad Separación de compuestos con PE ~ Limitaciones: Muestras volátiles o fácilmente vaporizables Deficiente para compuestos iónicos o de PM > 600 Deficiente como técnica cualitativa y preparativa Cromatografía gaseosa

25 Cromatógrafo de gases

26 Esquema de un cromatógrafo de gases gas portador puerto de inyección columna registro medidor flujo sitio de referencia Detector cromatografía de elución

27 Puerto de inyección vidrio entrada gas portador columna cámara de vaporización salida de excedente Bloque de metal calentado salida de purga del septo septo de goma

28 Columnas tubulares abiertas (capilares) Columnas rellenas Columnas

29 flujo Diámetro interno (100 a 700 m) Sílice fundida poliimida Soporte recubierto con FE líquida SCOTWCOT FSOT Columnas tubulares abiertas (capilares) Columnas

30 FSOT WCOT SCOT Rellena

31 Fases estacionarias Nombre comercial Polidimetilsiloxano OV-1, SE-30 Poli(fenilmetildimetil)siloxano [10% fenil] OV-3, SE-52 Poli(fenilmetil)siloxano [50% fenil] OV-17 Poli(trifluoropropildimetil)siloxano OV-210 Polietilenglicol Carbowax 20M Poli(dicianoalildimetil)siloxano OV-275 Ejemplos de algunas fases estacionarias usadas en cromatografía de gases

32 FE no-polar poli(dimetilsiloxano) CG de 10 compuestos en FE de distinta polaridad Los compuestos aparecen casi en orden creciente de sus puntos de ebullición. El determinante principal de la retención en esta columna es la volatilidad de los compuestos hexano butanol 3-pentanona heptano pentanol octano metil etil cetona4 97propanol3 36pentano2 56acetona1 PE (°C)Compuesto

33 La FE muy polar retiene los solutos polares. Los primeros que se eluyen son los 4 alcanos, le siguen las 3 cetonas y por último los 3 alcoholes. La fuerza determinante de la retención es el enlace de hidrógeno con la FE. propanol butanol pentanol CG de 10 compuestos en FE de distinta polaridad FE polar poli(etilenglicol) hexano butanol 3-pentanona heptano pentanol octano metil etil cetona4 97propanol3 36pentano2 56acetona1 PE (°C)Compuesto alcanos cetonas

34 Efecto de la temperatura en el cromatograma Isotérmica a 45 °C Isotérmica a 145 °C Programada

35 Detector de conductividad térmica

36 Detector de ionización de llama (FID) terminal de la columna gas portador H2H2 aire llama electrodo colector

37 Detector de captura electrónica (Ni 63, Sr 90 ) aislante de la columna al desecho emisor radiactivo + electrodo - electrodo

38 CONDUCTIVIDAD TÉRMICA IONIZACIÓN DE LLAMA CAPTURA ELECTRÓNICA COMPUESTOSOrgánicos e inorgánicos. Algunos dañan los filamentos (HCl, Cl 2, haluros de alquilo) Orgánicos. No responde a CO, CO 2, SO 2, H 2 O Con átomos electronegat.(halu ros de alquilo, organometálicos, organofosforados) GAS PORTADORH 2, HeN 2, HeN 2, Ar SENSIBILIDADModeradaMuy buena LINEALIDADBuenaAmpliaLimitada TEMPERATURA LÍMITE 400 °C 225 °C (Tr) 350 °C ( 63 Ni) OTROSNo destructivo. Afectado por variaciones de temperatura y caudal Destructivo, requiere 3 gases y electrómetro No destructivo, requiere licencia, muestras secas y electrómetro

39 Análisis cuantitativo en CL y CG Área S [S] [S]/[P] Área S Área P Uso de patrones externo e interno S P S Uso de patrón externo Área S x SxSx Área P SxSx P

40 CROMATOGRAFÍA ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS Un espectrómetro de masas acoplado a un cromatógrafo líquido o a un cromatógrafo de gases es un potente detector para análisis cualitativo y cuantitativo La espectrometría de masas es una técnica basada en ionizar moléculas gaseosas, acelerarlas en un campo eléctrico y separarlas de acuerdo a sus masas Un espectro de masas es un gráfico que muestra la abundancia relativa de cada fragmento que llega al detector de un espectrómetro de masas


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