Lisozima Es una proteína presente en los hemocitos de camarón.

Presentación del tema: "Lisozima Es una proteína presente en los hemocitos de camarón."— Transcripción de la presentación:

1 Expresión recombinante de lisozima de camarón marino en Escherichia coli.

2 Lisozima Es una proteína presente en los hemocitos de camarón.
Componente de la respuesta antibacteriana de la defensa innata de crustáceos. Panaeus vannamei

3 Objetivo: Sobreexpresar Lisozima para el estudio de su función y propiedades biquímicas. Sistema de expresión bacteriano En invertebrados, la expresión de la lisozima está regulada y responde al estímulo bacteriano.

4 Las bacterias sintetizan proteínas en el citosol
no hay formación de puentes disulfuro ni glicosilación. Las proteínas recombinantes (Lyz) que no se pliegan forman CUERPOS DE INCLUSIÓN Alto rendimiento de proteínas desnaturalizadas que se pliegan sintéticamente

5 Clonado del cDNA de Lisozima
Templado: librería cDNA fágica de hemocitos de camarón Región codificante de lisozima amplificación por PCR Primers con sitios de restricción NdeI y BamHI

6 Primers de expresión: PV-Lyz-NdeI PV-Lyz-BamHI
Secuencia nucleotídica de cDNA de Lyz de camarón. Primers de expresión: PV-Lyz-NdeI PV-Lyz-BamHI

7 Amplicones analizados por electroforesis
Vector/inserto digeridos secuencialmente por BamHI y NdeI Ligación

8 Ligación : DNA Lys + vector pET5a
E. coli DH5α (LB, Ampicilina) *Identificación de recombinantes por colony PCR *Plásmidos de posibles transformantes: aislados por lisis alcalina Clones positivos secuenciados con primers T7 y PV-Lyz-BamHI

9 5 clones recombinantes de Lyz
La identidad de la banda de 500 pb se confirmó por secuenciación del DNA Inserto de Lyz

10 Expresión de la proteína recombinante
pET5a-Lyz BL21 Rosetta Gami -LacZ E. coli * caldo Lb, Amp, Kan, Tetr, Cloramf * agitación a 37°C hasta OD de 0.6 a 600 nm.

11 Identificación de presencia de pET5a-Lyz
Cepas transformadas Screening por colony PCR usando primers: PV-Lyz-BamHI (de Lyz) T7 (del vector)

12 Sistema de expresión bacteriano en E. coli
Expresión controlada del gen de interés por T7 RNA polimerasa. T7 RNA polimerasa Operón lac La proteína expresada bajo el control del operón Lac se sintetizará en presencia de lactosa o un inductor análogo artificial, llamado IPTG

13 Expresión de lisozima. Inducción con IPTG a una concentración final de 0.4mM. ~ 17 KDa Aumento de la intensidad de la banda HEL: Lisozima de clara de huevo

14 Protocolo para cuerpos de inclusión y re-plegamiento
Se determinó por SDS-PAGE que Lyz se expresa como cuerpos de inclusión. Protocolo para cuerpos de inclusión y re-plegamiento Aislamiento de cuerpos de inclusión Testeo con 16 buffers Re-plegamiento Purificación Se utilizo DTT para reducir cualquier enlace disulfuro durante la desnaturalización de la proteína.

15 Búsqueda de condiciones de re-plegamiento.
El re-plegamiento de proteínas que contenían puentes disulfuro no es trivial. Testeo de 16 buffers por dilución de la solución de los cuerpos de inclusión, el re-plegamiento fue identificado por actividad enzimática en la solución. Buffer N° 13 fue utilizado para el re-plegamiento a gran escala de Lyz desnaturalizada, el cual permitió el re-plegamiento activo de Lyz con un mayor rendimiento

16 Re-plegamiento de Lyz. Diálisis.
Separación de moléculas según su tamaño.

17 Detección de la actividad enzimática
Re-plegamiento de Lyz. Diálisis Centrifugación rpm Sobrenadante (contiene Lyz) Ultrafiltración (aislamiento) Concentró la muestra Detección de la actividad enzimática La proteína fue reoxidada por una combinación de Glutation reducido /oxidado Formación de puentes disulfuros

18 Banda de ~ 17 KDa es el componente principal de los cuerpos de inclusión.
Lyz: Proteína replegada luego de la ultrafiltracion y concentrada. IB: Cuerpos de inclusión antes de la extracción. La concentración de la proteína fue monitoreada, se obtuvo rendimiento total de 10.4% para un total 6.75mg/lt de medio.

19 Actividad de Lisozima. Formación del halo donde la enzima lisó las bacterias. La preparación era activa contra Micrococcus luteus. Control Lyz: replegada y purificada. RB: Buffer Nº13.

20 Conclusión Obtención de cantidades suficientes de lisozima recombinante. Rendimiento total de 10.4%,para un total 6.75mg de Lyz/l de medio. La expresión recombinante debería utilizarse en conjunto con una purificación cromatográfica de proteínas, teniendo el cDNA disponible o haciendo uso de las secuencias disponibles en Genbank. Re-plegamiento es un paso crítico.

21 Producción de proteínas recombinantes en sistemas bacterianos.
Ventajas Bajo costo comparado a distintos sistemas eucariotas superiores. Tiempo de replicación muy bajo (20 min) de E.coli. Fácil utilización. Alcanza alta densidad en cultivo utilizando sustratos baratos. Son sistemas genéticamente bien caracterizados (se conocen secuencias de represores y promotores) Hay una amplia disponibilidad de vectores y cepas mutantes para una gran variedad de usos.

22 Producción de proteínas recombinantes en sistemas bacterianos.
Desventajas Algunas proteínas producidas en bacterias se tornan inestables o carecen de actividad biológica (no hay modificaciones post-traduccionales). Generación de endotoxinas dañinas para la salud. Ineficiente secreción de la proteína al medio de cultivo. Formación de cuerpos de inclusión

23 Fin Paula Gonzalez – Flavia Piccioni