CONCEPTOS BÁSICOS BIOLOGÍA MOLECULAR I DR.JP FLORES G.

Presentación del tema: "CONCEPTOS BÁSICOS BIOLOGÍA MOLECULAR I DR.JP FLORES G."— Transcripción de la presentación:

1 CONCEPTOS BÁSICOS BIOLOGÍA MOLECULAR I DR.JP FLORES G.

2

3 Biología Molecular en Patología
Las pruebas moleculares permiten examinar la estructura y expresión de genes específicos o proteínas en tejidos normales, anormales o neoplásicos . Con la finalidad de evaluar posibilidades de diagnóstico, tratamiento o pronóstico en una gran variedad de patologías .

4 DNA

5 Secuencias de nucleótidos unidos consistentes en :
Ácidos Nucleicos Secuencias de nucleótidos unidos consistentes en : Base Nitrogenada Azúcar de 5 carbonos Grupo fosfato La secuencia de las bases es la forma en que la información genética es almacenada

6 Bases Pirimidinas Las bases C= , A= y G= Citosina ( C= )
Timina ( T= ) Uracilo ( U= ) Purinas Adenina ( A= ) Guanina ( G= ) Las bases C= , A= y G= se encuentran en el DNA y en el RNA. Sin embargo la base T= es específica para el DNA y el U= es específica para RNA.

7

8 Complejo DNA/Proteína
RNA mensajero RNA ribosomal Transcripción Amplificación

9

10 Cromosoma/Gene

11 Delecion Duplicación

12 Traslocación Inversión

13

14

15 Replicación celular Reactivación 1 Hr. 6 a 12Hs. 3 a 4 Hs. 2 a 4 Hs.

16 Replicación celular Conceptos sobre replicación celular: Interfase
Duplicación del material fenotípico y genético Doblar tamaño trascripción y trasducción de los genes Diploide de cromosomas

17 Cromosoma/Gene

18 Conceptos Cancer Cancer es una enfermedad genética
Protooncogenes (dominantes) Genes supresores (Recesivos) Genes que regulan la muerte celular programada o Apoptosis Genes relacionados con la reparación del ADN. (Inestabilidad ADN)

19 Conceptos Cancer Inmortalización Transformación
Ventajas de crecimiento Metastasis Contenido ADN aneuploide Alts. Genéticas

20

21

22 Biología del crecimiento tumoral
Transformación Crecimiento Invasión local Metástasis Cinética del crecimiento Angiogénesis Heterogeneidad

23 Masa tumoral: formada por descendientes clonales de una célula transformada .

24

25 Cinética del crecimiento
Regulación del ciclo vital alterado (Rb, p53 y ciclinas) Posteriormdisminuye (20%) Fracción de crecimiento elevada (# de células tumorales en proliferación, [FC]) Duración de ciclo vital igual o mayor Crecimiento producción = pérdida celular Vel de crecim

26 Cinética de Crecimiento
Quimioterapia actúa sobre células que se encuentran en su ciclo celular. Tumor Factor de crecimiento Aplicación de quimiotx Respuesta Agresivo No agresivo Sin cirugía Cirugía

27 Distancia de máxima difusión de óxígeno
Angiogénesis Tumoral Elemento Nutritivos y O2 Factores de crecimiento (PDGF, GM-CSF, IL-1) Metástasis Distancia de máxima difusión de óxígeno (1-2mm)

28 clon célula mutación tumor Fenotipos de angiogénesis mutada libre
Normal = p53 Nat sx trombospondina antiangiogénesis mutada libre Tumor =p Niveles trombop Angiogénesis clon célula mutación tumor Multiples mutaciones Fenotipos de angiogénesis

29 También hay Control de anti-angiogénesis
sx Trombospondina -1 Angiostatina Endostatina Vasculostatina Degradacción del plasminógeno, colágena y transrretina sx

30 Progresión y heterogeneidad de los tumores
Progresión tumoral: La malignidad se adquiere de forma progresiva 1 Preneoplásico - tumor benigno -tumor maligno Crecimiento acelerado Capacidad de invasión Metástasis

31 Biología del crecimiento tumoral
Transformación Crecimiento Invasión local Metástasis Cinética del crecimiento Angiogénesis Heterogeneidad

32 Invasión de la matríz extracelular
Proceso activo que se divide en varios pasos 1) Separación de células tumorales del resto de la masa. 2) Fijación a los componentes de la matríz. 3) Degradación de la matríz extracelular. 4) Emigración de las células tumorales. Membrana basal y tejido conjuntivo. Colágeno, proteoglucanos y glucoproteinas.

33 Disminución de cadherina E r/o Mutación cateninas.

34 Rc laminina, fibronectina y expresión de integrinas.

35 Enzimas proteolíticas (propias del huesped)
Serina, Cisteina de la matríz (MPM)

36 Factores de motilidad autocrino
(timosina, fc.Crecim. hepatocitario) Productos de degradación de los componentes de la matríz.

37 Diseminación vascular y asentamiento de las células tumorales
Penetran en circulación y se agupan entre ellas y con células sanguineas (plaquetas) Viajan como embolo y se extravasan hacia organo diana (moleculas de adherencia - CD44) Tropismo orgánico Ca próstata - esqueleto Ca broncogenico - suprarrenal y encéfalo Neuroblastomas - hígado y hueso

38

39 Tropismo Orgánico Células tumorales: molécula adherencia con preferencia a células endoteliales del órgano diana. Célula diana: liberan sustancias quimiotácticas. Organo diana: ambiente desfavorable.

40 Genética molecular de las metástasis
“Gen metastásico” Genes supresores de la metástasis. - Gen de cadherina E. - Gen de inhibidor histico metaloproteasas. - nm ca mamario - KA I-1 (crom IIp II-2) ca próstata - Kiss-1 (crom IIp) melanoma maligno

41

42

43

44 Carcinogénesis 1.- Cambio en la función de un gen
2.- Función anormal de un gen 3.- Cambios estructurales de los genes Sin alteración cromosómica no existe transformación neoplásica

45 Proliferación Célula suceptible Factores ambientales Virus, radiación
Diferenciación genes Apoptosis Célula suceptible Genes asociados a proliferación celular

46

47 Mecanismos moleculares CA Colon
Mutaciones APC Y MCC Perdida de gpos. Metilo ADN Mutaciones del Gen RAS Perdida de Gen DCC Perdida de P53

48

49

50

51 Adenoma plano

52

53

54 Oncogenes Seminars in Oncology Vol.23:4-21 1996 Oncogen Función Tumor
HST Crecimiento Ca.gástrico NEU/ERB Crecimiento Ovario,mama TRK Crecimiento Ca.tiroides,Colon HaRAS,K-RAS, Trasduccion Ca.vejiga,Colon de proteínas ABL Cinasas de proteínas Leucemia/Linfoma MYC/BCL Factores de Trasduccion Neuroblastoma Nucleares Linfomas Seminars in Oncology Vol.23:

55 Gen supresor tumoral Alteración de la funcionalidad de ambos alelos de un gen que regula la diferenciación celular o la supervivencia la pérdida de estos resulta en la transformación maligna.

56

57 P53 Guardian ADN

58 Genes Supresores Tumorales
Gene S. Familiar T.Esporádicos c/Mutación Mx de Acción RB Retinoblastoma RB,OSC,Pulmón,Mama Ciclo Celular P S.Li-Fraumeni % canceres Daño DNA P Melanoma,Ca.Pancreas Ca.pancreas,Gliomas Inhibidor CDK hMSH-2 Ca.Colon Ca.Colon,Endometrio Reparación DNA hMLH-1 APC Pólipos adenomatosos Ca.Colon Wnt factores crecimiento BRCA1 Ca.Mama,Ovario Ovario(raro) Reparación DNA ? BRCA2 Ca.Mama,Ovario,Páncreas Ca.Páncreas Reparación DNA? NF Neurofibromatosis tipo 1 Neuroblastoma Melanoma Ras NF Neurofibromatosis tipo 2 Meningioma, Mesotelioma M.Citoesqueleto Shwanoma,Ependimoma

59 ADN Molecula de Estrogeno Receptor de estrogenos Respuesta Mediada
RNAm

60

61

62

63

64

65 Evidencia a favor de Efecto hormonal en Adenocarcinoma de Mama
Pacientes con ooforectomia rara vez desarrollan cancer de mama Pacientes con S de Turner rara vez desarrollan ca de mama Xenoestrogenos favorecen el desarrollo de ca de mama Los pacientes con RE positivos responden a terapias con tamoxifen

66

67 Microorganismos oncogénicos
Agentes Carcinógenos Químicos Energía radiante Microorganismos oncogénicos

68 Carcinogénesis Química
John Hill - rapé -pólipos Percival Pott - hollín - ca escroto Hidrocarburos aromáticos policíclicos Sustancias sintéticas Fármacos

69 Fase de la carcinogenesis química
Iniciación y promoción

70 INICIACION acción directa Naturales ó sintéticos acción indirecta ó procarcinógenos Activación (carcinogeno) Inactivación (destoxificación) Monooxigenosa dependiente de citocromo P-450 CYP1A1, Stransferasa (BST), edad, sexo, nutrición

71 CARCINOGENOS QUIMICOS
Indicador mutágeno Diana DNA Cada carcinógeno produce una “huella dactilar” molecular China y Africa aflatoxina B1 Ca. Hepatocelular - mutación p mutación 249 p53. Otras Otras regiones V Hepatitis B. Otras mutaciones en p53 P/iniciación: Celulas alteradas por carcinógeno deben sufrir al menos 1 ciclo de proliferación

72 PROMOCION Capacidad carcinogénica de alguna sustacias cuando se administra un promotor que por si mismo no es tumorgénico TPA, Acido ocadoico NUEVAS INICIADOR PROMOTOR MUTACIONES Proliferación y Actividad de un expansion cronal de Tumor oncogen células indicadas maligno Nada Lesión Lesión hiperplásica preneoplasica

73

74 CARCINOGENOS QUIMICOS
Agentes alquilantes de acción directa Hidrocarburos aromáticos policíclicos Aminas aromáticas y colorantes nitrogenados Carcinógenos naturales Nitrosaminas y amidos Agentes diversos Promotores de la carcinogenesis química

75

76 CARCINOGENESIS POR RADIACIÓN
Rayos UV (UVA, UVB, UVC) R. Ionizante (electomagnetico o particular)

77 RAYOS ULTRAVIOLETA UVA 320-400nm UVB 280-320nm carcinógeno
UVC nm carcinógeno, filtrado por capa Z0NO Epidemiología - Ca. Espinocelular, basocelular, melanoma Factores: Tipo de UV, Intensidad exposición, cantidad melanina

78 NER ( nucleotide excision repair)
1) Reconocimiento 2) Incision 3) Eliminación 4) SX parche 5) Unión del parch sobrepasa capacidad sol NER error en DNA transcripción dañado Xeroderma pigmentoso

79 XERODERMA PIGMENTOSUM
Autosómico recesivo Fotosensibilidad extrema riesgo ca(2000 veces) Anomalías neurológicas Incapacidad p/reparar DNA por lesiones UV 7 variantes

80 - Mama, pulmón y glándula salival
RADIACIÓN LONIZANTE Cualquier célula podrá transformarse en cancerosa si recibe una cantidad suficiente de energía radiante Ca provocado por radiación: Piel, hueso y TGI: son los menos involucrados - Leucemias - Ca. Tiroides - Mama, pulmón y glándula salival

81 EJEMPLOS Rayos roetgen - Ca. Piel Mineros de elem radioactivos –
Ca. Pulmón (10 v+) Bombas Hiroshima y Naggsaki – 7 a: leucemias a: tumor solido R. Terapeuticos: Cabeza y Cuello = 9% CA tiroides : Columna x E.A= leucemia (10-12 v+) Accidente Chernobil - Ca. Tiroides mama, tiroides colon, pulmón

82 CARCINÓGENOS VIRALES Y MICROBIANOS
Virus DNA oncogenicos (VPH, VEB) Virus RNA oncogenicos ( VLTH-1) Bacterias (Helicobacter pylori)

83 VIRUS DNA ONCOGENICOS -VPH
70 Tipos VPH 1, 2, 4, prod papilomas escamosos benignos 6, condiloma genital con escaso pontencial maligno 16, 18 (31, 33, 35, 51) Ca in situ 85% y Ca invasores Lesión preneoplásica - Forma episómica del VPH Lesión neoplásica - Forma integrada del VPH. (clonal) ciclo NL (-) transcripción normal E1 / E E6/E E E6 PRB p53-P INFECT Interrupción - - codifica E6/E cant gran afinidad VPH 16, 18, 31 E6 P53-a VPH Interrupción - - codifica E6/E cant poca afinidad Alteración leve bajo riesto del ciclo celular Regulación del ciclo células alterado 7 veces > riesgo de Ca. que

84 Virus DNA oncogénico VEB

85 Antigenos Tumorales AET - Solo en células tumorales, desencadenan a células T citotóxica y se presentan sobre la celular por molecula I MHC. AAT - Genes en células normales (pero no expresado) y en células tumorales. Fam. Genes MAGE, GAGE, BAGE, RAGE. Expresión excesiva de antigenos c-erb B2 (o neu) - en células tumorales su expresión y activa a linfos T CD8 citotox. Antigenos virales E7 del VPH-16 Antigenos de diferenciación CD10 (CALLA) - Leucemias y Linfomas B Ag prostático específico

86

87 Mecanismos Efectores Antitumorales

88 Inmunovigilancia SIDA, XLP. Otras inmuno del veces > prob. de Cancer Dx sanos - mecanismos p/evadir inmunodeficiencia - células tumorales no expresan HLA clase I - no expresan moleculas coestimulantes - inhiban respuesta inmune ((+) LT supresor) - apoptosis de células T citotox. (ligados FAS)

89 Efectos del tumor en el huesped
Daño por : - localización y efecto de masa - actividad funcional - hemorragias o infecciones -sintomas agudos

90 Efectos locales y normales
Tumor endocrino benigno endocrinopatia Cancer en una glándula insuficiencia Cancer colon obstrucción Presión tumor benigno Erosion y destrucción tumor maligno

91

92 Caquexia Síndrome: Pérdida de grasa y masa corporal
con dedebilidad, anorexia, anemia - Alteación: gusto y olfato - Gasto Calórico e indice metabólico basal - Es reproducible al administrar FNT

93 Síndrome Paraneoplásico
Signos y síntomas de un px. con Ca. que no se explica por efecto del tumor local, metástasis ni actividad funcional. Producción hormonal ectópica (Cushing) 50% Ca. Pulmón Hipercalcemia (mama, pulmón, riñón, ovario) Síndrome neuromiopático: Ac anti tumor Rx cruzada c/neuronas Acantosis Nigricans: 50% con años y Ca. Osteoartropatía hipertrófica: 1-10% de Ca. Broncogénicos

94

95 Graduación y estadificación de los tumores
Mediante - grado de diferenciación y mitosis existentes Es proporcianal a la agresividad (I - IV) 2 Sistema UICC = Sistema TNM TO= in situ, T1 - T4 tamaño NO= no ganglios, N1 - N3 # ganglio afectados MO= no mets MI - mets presente Mz - Mets Hematógena 2 AJCC - O - n Tamaño, ganglios, metástasis

96 Diagnóstico del cancer
Histológico y citológico Inmunotinción Diganóstico molécular Citometría del Flujo Marcadores Tumorales Datos clínicos muestra adecuada y representativa material bien fijado por BAAF, biopsia, BTO técnica de apoyo

97 Historia Tinción facilita la distinción diferentes componentes celulares. HyE Weigert, Harris, Mayer 1939 Histoenzimología 1942 Coons Inmunoflourescencia 1972 Nakane-Avrameas Peroxidasa Hsu Complejo Avidina –Biotina 1972 Stenberg PAP 1992 Adams Ampificación Tirimidina

98 Tinción especial Subjetividad histopatologia
Identificar célula en particular , tejido o enfermedad Técnica auxiliar Sensibilidad y especificidad aceptable en el diagnóstico morfológico Posibilidad de clarificar la histogénesis

99 1940 1950 1960 1970 1980 1990 Telepatología 3D Morfo In situ PCR
Computadoras HIS PCR IHQ Biología Molecular Histoquímica Inmunología ME Química Bioquímica Física

100 Métodos en Patología Qx.
Macroscopico Microscopia luz Histoquimica Inmunohistoqx. Ultraesructura Citopatologia CFU Análisis de Imagen Hibridización In situ PCR FISH

101 Macro melanosomas IHQ PAS HISF

102 Inf. Clínica Técnica Especimen Resultados

103 Consideraciones Técnicas
Especimen: Bloques celulares Citología o frotis secado al aire Citologías teñidas previamente Citologías BAAF Transferencia de células

104 Transferencia de celulas
PAP HMBE-1 ACE CK8

105 Logística de Estudio Lesiones Neoplásicas Citopatología
Evaluación Clínica y sitio de la lesión Grupos Morfológicos I. Epitelioides II. Fusocelulares III. Mixtos IV. Células pequeñas Panel Racional Inicial Citopatólogo CA vs. Melanoma CA vs. Linfoma Linfoma vs. TNEP CA sarc. vs. Sarcoma DX. Diferencial

106 PLAP

107 Réglas Básicas Interpretación
G.secretorios Filamentos Filamentos Sinaptoficina CK8 Actina Cromogranina

108 Réglas Básicas Interpretación
Lámina basal Filamentos Filamentos Filamentos Colagena IV Desmina Actina

109 Historia Clinica 1 Paciente masculino campesino de 58 años de edad con tumor en region cervical Tele de Torax normal TAC normal Estudios de laboratrio dentro de limites normales

110 Diagnosticos diferenciales
Melanoma Histocitoma Fibroso Maligno Carcinoma sarcomatide Sarcoma epitelioide

111 HMB45 CK 13 Cocktail CK CD 68 Negativo Prot S-100 negativo CK8 negativo CK 7 Negativo CD 10 Negativo Carcinoma Espinocelular sarcomatoide

112 Inmunofenotipo Patología Quirúrgica
Proceso reactivo vs. Neoplásico Linfoma vs. Neoplasia no Linfoide Inmunotipificación de Linfomas

113 Protocolo de Estudio Lesiones Neoplásicas Poco Diferenciadas
ME, PCR BM G. Morfológicos I. Epitelioides II. Fusocelulares III. Mixtos IV. Células pequeñas Evaluación Clínica y sitio de la lesión No Concl. Dx Def. Morfología Panel p/ SC Panel Dx Inicial Dx. Histogenetico

114 Clasificación de tumores indiferenciados
CK epitelial VIM mesenquimatoso Des muscular PAGF gliales ACL linfomas APE tiroglobulina - ca específico

115

116 Diagnóstico molecular
Diferenciar población polimonoclonal Detección de traslocaciones por FISH Detección de transcripción por PCR Determinar el pronóstico Detección de enfermedad residual por PCR Predisposición hereditaria BRCA1, BRCA2 RET.

117

118

119 Diagnóstico Pronóstico y R=Tx Selección y manejo Tx.génico

120 Personas normales 1 1 2 D 2l de DNA D 1l de DNA B ZP3 ZP3 Her-2/Neu Her-2/Neu N° de copias Pacientes M marcador de peso molecular B A M 6. 01Q HSJ 7. GG a 8. 01Q- 658 9. GG- 3275D 10. 01Q- 815B 11. 01Q- 1111B 12. 01Q- 978B 1 10 M 2 28 3 11 4 10 ZP3 5 10 6 12 Her-2/Neu 7 12 8 24 9 08 10 24 11 04 12 02

121 Citometría de flujo - Identificación de antígenos de superficie
- Aneuploidia pronóstico Marcadores tumorales - Apoyo al diagnóstico - Indican recidiva - Establece respuesta al tratamiento (AFP, CEA, HGC, etc)

122

123

124

125

126

127

128

129

130

131

132

133

134

135

136

137

138 Gracias por escuchar A mi papá.