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PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS Bioq. Natalia Peralta Parasitología y Micología Facultad de Química, Bioquímica.

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1 PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS Bioq. Natalia Peralta Parasitología y Micología Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia. Universidad Nacional de San Luis - Herramientas convencionales aplicadas según la etapa (métodos parasitológicos e inmunológicos). - Reactivos disponibles en el medio.

2 D IAGNÓSTICO DE LABORATORIO La Enfermedad de Chagas es una de las endemias más importantes en nuestro país, siendo uno de los problemas de Salud Pública de mayor distribución en América Latina. Para su correcto diagnóstico se deben evaluar los datos clínicos, de laboratorio y epidemiológicos. El laboratorio juega un rol fundamental y muchas veces determinante en el diagnóstico de la infección.

3 D IAGNÓSTICO DE LABORATORIO La enfermedad de Chagas presenta tres etapas clínicas: a) aguda b) indeterminada c) crónica Debemos tener en cuenta el período ventana que se produce cuando T.cruzi ingresa al organismo, cumple sus primeros ciclos de desarrollo en el hospedador, que abarca entre 7 a 15 días, período después del cual recién se pueden detectar parásitos circulantes y posteriormente anticuerpos contra el parásito.

4 D IAGNÓSTICO DE LABORATORIO Por esto es fundamental conocer tres aspectos: Cuándo realizar un análisis Qué análisis realizar Cuales son los objetivos del análisis Para evitar la realización de estudios parasitológicos y/o serológicos en un momento inadecuado, con la consecuencia de posibles falsos resultados negativos.

5 D IAGNÓSTICO DE LABORATORIO Luego del período de Ventana se presentan parasitemias, las que van disminuyendo a medida que transcurre el tiempo, hasta hacerse mínimas o aleatorias. ETAPA AGUDA El diagnóstico de laboratorio debe centrarse en la búsqueda del parásito. MÉTODOS PARASITOLÓGICOS

6 D IAGNÓSTICO DE LABORATORIO ETAPAS INDETERMINADA y CRÓNICA El diagnóstico se realiza mediante la demostración de anticuerpos específicos anti Trypanosoma cruzi. MÉTODOS SEROLÓGICOS

7 D IAGNÓSTICO DE LABORATORIO En nuestro país, el diagnóstico serológico debe efectuarse por dos reacciones en paralelo, y en caso de discordancia, se debe recurrir a una tercera prueba a fin de definir el resultado.

8 E TAPA A GUDA M ÉTODOS P ARASITOLÓGICOS

9 TOMA DE MUESTRA MOMENTO DEL CONTAGIO Deben realizarse al menos DOS pruebas serológicas para Chagas, a los fines de conocer si el paciente tiene ya una infección previa. Si la misma es negativa la segunda muestra debe ser obtenida respetando el periodo de ventana desde el inicio de la posible infección.

10 ETAPA AGUDA En esta etapa deben realizarse fundamentalmente los MÉTODOS PARASITOLÓGICOS MÉTODOS PARASITOLÓGICOS, los cuales pueden ser realizados por distintos procedimientos analíticos, dependiendo de la disponibilidad de recurso humano capacitado y equipamiento en cada laboratorio. La DETECCIÓN DEL PARÁSITO, como en toda enfermedad infecciosa, es el único parámetro de CERTEZA DIAGNÓSTICA.

11 MÉTODOS PARASITOLÓGICOS GOTA FRESCA GOTA GRUESA TÉCNICA DE CONCENTRACIÓN DE STROUT MICROSTROUT / MICROMÉTODO HEMOCULTIVOXENODIAGNÓSTICO

12 GOTA FRESCA D IAGNÓSTICO DE LABORATORIO - ETAPA AGUDA METODOS PARASITOLÓGICOS -GOTA FRESCA Aumentar irrigación Sensibilidad 50% 10x / 40x gota de citrato al 2%) Trypanosoma cruzi 45 minutos

13 GOTA GRUESA D IAGNÓSTICO DE LABORATORIO - ETAPA AGUDA MÉTODOS PARASITÓLOGICOS -GOTA GRUESA Sensibilidad 50% Colocar 1 a 3 gotas Desfibrinar 1-2min Dejar secar Colorear con Giemsa diluido (1/20) 30 minutos. Lavar y secar objetivo de 100x aceite Trypanosoma cruzi

14 STROUT D IAGNÓSTICO DE LABORATORIO - ETAPA AGUDA MÉTODOS PARASITOLÓGICOS -STROUT Sensibilidad 95% 5-10 mL Tº amb Retracción del coágulo 600 rpm 2 min rpm 10 min. Suero Sedimento Objetivos de 10x y 40x (45 minutos) Sobrenadante

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16 MICROMÉTODO /MICROHEMATOCRITO D IAGNÓSTICO DE LABORATORIO - ETAPA AGUDA MÉTODOS PARASITOLÓGICOS -MICROMÉTODO /MICROHEMATOCRITO Sensibilidad 90 a 95% 45 segundos a 5000 rpm 6 a 9 microhematocrito heparinizado Cerrar extremo con plastilina Cortar BIOSEGURIDAD Objetivos de 10x y 40x (45 minutos)

17 La técnica de MICROHEMATOCRITO NO ES RECOMENDABLE Puede brindar falsos resultados negativos: Si el capilar es centrifugado a las revoluciones no adecuadas, existe la posibilidad de que los parásitos se vayan al fondo del capilar con el riesgo de no ser visualizados. Que el paciente curse con bajas parasitemias y sea muy difícil de observar la presencia del parásito en la interfase, entre la capa de glóbulos blancos y el suero. Si el capilar se rompe en la interfase, pueden quedar restos de vidrio del capilar sobre el portaobjetos con los restos de la interfase y cuando se coloca el cubreobjeto, no tiene una adecuada adherencia y dificulta la observación. Por razones de Bioseguridad del operador: Ya que para su observación deben cortarse aproximadamente 7 capilares, para aumentar su sensibilidad y los restos de vidrios pueden traspasar los guantes del operador e incluso herirlo, sin que éste lo perciba, pudiendo adquirir infecciones como Hepatitis, HIV, Chagas, etc. La técnica de MICROHEMATOCRITO NO ES RECOMENDABLE Puede brindar falsos resultados negativos: Si el capilar es centrifugado a las revoluciones no adecuadas, existe la posibilidad de que los parásitos se vayan al fondo del capilar con el riesgo de no ser visualizados. Que el paciente curse con bajas parasitemias y sea muy difícil de observar la presencia del parásito en la interfase, entre la capa de glóbulos blancos y el suero. Si el capilar se rompe en la interfase, pueden quedar restos de vidrio del capilar sobre el portaobjetos con los restos de la interfase y cuando se coloca el cubreobjeto, no tiene una adecuada adherencia y dificulta la observación. Por razones de Bioseguridad del operador: Ya que para su observación deben cortarse aproximadamente 7 capilares, para aumentar su sensibilidad y los restos de vidrios pueden traspasar los guantes del operador e incluso herirlo, sin que éste lo perciba, pudiendo adquirir infecciones como Hepatitis, HIV, Chagas, etc.

18 NUEVO MICROMÉTODO D IAGNÓSTICO DE LABORATORIO - ETAPA AGUDA MÉTODOS PARASITOLÓGICOS -NUEVO MICROMÉTODO Sensibilidad 90 a 95% 1 min a 3000 rpm 1 gota de heparina + 0,5 ml de sangre venosa Tubo Eppendorf (1,5 ml de capacidad) Objetivos de 10x y 40x (45 minutos) Mezclar por inversión Tomar una gota de la interfase (capa de glóbulos blancos)

19 HEMOCULTIVO D IAGNÓSTICO DE LABORATORIO - ETAPA AGUDA MÉTODOS PARASITOLÓGICOS - HEMOCULTIVO C onsiste en sembrar una muestra de sangre en un medio de cultivo artificial y amplificar el número de parásitos. Como producto del cultivo se obtienen epimatigotes de T. cruzi.

20 Existen técnicas estandarizadas con sangre heparinizada, recolectada en condiciones de estricta asepsia, en medio monofásico (Infusión Cerebro Corazón) y bifásico (pico de flauta de agar sangre). Se incuba a 28ºC y se realizan observaciones microscópicas y subcultivos periódicos, desde los 7 y hasta un máximo de 60 días. Existen técnicas estandarizadas con sangre heparinizada, recolectada en condiciones de estricta asepsia, en medio monofásico (Infusión Cerebro Corazón) y bifásico (pico de flauta de agar sangre). Se incuba a 28ºC y se realizan observaciones microscópicas y subcultivos periódicos, desde los 7 y hasta un máximo de 60 días.

21 El método del hemocultivo es de elección por su menor agresividad para los pacientes, fundamentalmente en la población neonatal, mayor precocidad de resultados y menor requerimiento en infraestructura.

22 XENODIAGNÓSTICO D IAGNÓSTICO DE LABORATORIO - ETAPA AGUDA MÉTODOS PARASITOLÓGICOS - XENODIAGNÓSTICO C onsiste en amplificar el nº de parásitos utilizando al vector. Se utilizan ninfas de Triatoma infestans, del tercer o cuarto estadio.

23 Se realiza con la aplicación de 4 cajas con 20 ninfas de Triatoma infestans, del tercer o cuarto estadio, con 20 días de ayuno, cubiertas con una gasa, sujetada con una banda elástica. Se sujeta al antebrazo durante 15 o 20 minutos.

24 Luego se deja a 28ºC y 70% de humedad durante 30 o 60 días. El material se obtiene por compresión de la zona abdominal del insecto, entre dos pinzas, sobre un portaobjetos, y se lo diluye con solución fisiológica estéril, luego se agrega un cubreobjeto y se observa con objetivo de 40x, recorriendo aproximadamente 300 campos en guarda griega.

25 ventajasdesventajas Strout, Microstrout Resultado precoz Certeza diagnóstica Sencillez operativa Bajo costo Sensibilidad operador dependiente HemocultivoElevada sensibilidad Certeza diagnóstica Facilidad en la obtención de la muestra Bajo costo Requiere experiencia del operador Contaminaciones XenodiagnósticoGold standardMétodo cruento Reacciones alérgicas Infraestructura compleja Enfermedad de Chagas Diagnóstico parasitológico

26 En resumen, los métodos parasitológicos clásicos: EXAMEN EN FRESCO, STROUT O MICROSTROUT y HEMOCULTIVO empleados secuencialmente, permiten detectar el parásito, y consecuentemente efectuar el diagnóstico de certeza, prácticamente en el 95% de los casos durante el período agudo.

27 E TAPA I NDETERMINADA Y C RÓNICA M ÉTODOS S EROLÓGICOS

28 El concepto básico que debe tenerse en cuenta es que lo que se busca no es el parásito y, por lo tanto, sus resultados nunca proporcionan certeza diagnóstica y deben medirse en términos de probabilidad.

29 Para que las probabilidades de éxito en el diagnóstico serológico se acerquen a la certeza es imprescindible seleccionar adecuadamente El MÉTODO A EMPLEAR, EL MOMENTO DE LA TOMA DE MUESTRA e INTERPRETAR ADECUADAMENTE LOS RESULTADOS. Para que las probabilidades de éxito en el diagnóstico serológico se acerquen a la certeza es imprescindible seleccionar adecuadamente El MÉTODO A EMPLEAR, EL MOMENTO DE LA TOMA DE MUESTRA e INTERPRETAR ADECUADAMENTE LOS RESULTADOS.

30 MÉTODOS SEROLÓGICOS - HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA (HAI) - ELISA (Enzyme-Linked Inmuno Sorbent Assay) - INMUNOFLUORESCENCIA(IF) Los métodos actualmente validados son:

31 Se basa en la propiedad que tienen las proteínas de adsorberse sobre la superficie de glóbulos rojos de carnero o de ave modificada químicamente y actuar como soporte del antígeno. Si en el suero del paciente existen anticuerpos contra los antígenos del parásito, los glóbulos rojos se aglutinan. HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA D IAGNÓSTICO DE LABORATORIO - ETAPA INDETERMINADA Y CRÓNICA MÉTODOS SEROLÓGICOS - HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA

32 Consiste en placas de poliestireno con antígenos solubles del Trypanosoma cruzi pegados. Sobre cada uno de los reservorios de la placa se coloca suero de pacientes que, si tienen anticuerpos se unen a los antígenos del Tripanosoma. ELISA D IAGNÓSTICO DE LABORATORIO - ETAPA INDETERMINADA Y CRÓNICA MÉTODOS SEROLÓGICOS - ELISA

33 Luego se agrega un reactivo constituído por anticuerpo anti inmunoglobulinas humanas marcado con una enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina) y posteriormente, se agrega un sustrato de la enzima que, si en la fase sólida se encuentra el doble complejo antígeno- anticuerpo del paciente- anticuerpo marcado, desarrolla un color cuya intensidad es proporcional a la concentración de anticuerpos del paciente y a la afinidad de los mismos.

34 Tiene un fundamento similar al método de ELISA, con algunas diferencias importantes. La primera es que el antígeno es particulado (el parásito entero fijado con formaldehído o glutaraldehído). La segunda diferencia radica en que el segundo anticuerpo está marcado con una sustancia fluorescente, ususalmente isotiocianato de fluoresceína y, por último, la lectura se realiza en un microscopio equipado con luz UV. INMUNOFLUORESCENCIA D IAGNÓSTICO DE LABORATORIO - ETAPA INDETERMINADA Y CRÓNICA MÉTODOS SEROLÓGICOS - INMUNOFLUORESCENCIA

35 Los parámetros para determinar la confiabilidad de un método son: - Sensibilidad (S) - Especificidad (E) - Valor predictivo (VP) S: capacidad de un método de dar resultado (+) en presencia de infección. E: capacidad de un método de dar resultado (-) en ausencia de infección. VP: probabilidad que un individuo con resultado (+) esté realmente infectado (VP+) o de que un individuo con resultado (-) sea realmente no infectado (VP-). Las dos primeras son intrínsecas del método, en cambio el VP depende de la prevalencia de la infección. Así, en zona de alta endemicidad el VP+ de un resultado positivo es más alto que en una zona no endémica (y por lo tanto la probabilidad de resultado falso positivo es menor). Los parámetros para determinar la confiabilidad de un método son: - Sensibilidad (S) - Especificidad (E) - Valor predictivo (VP) S: capacidad de un método de dar resultado (+) en presencia de infección. E: capacidad de un método de dar resultado (-) en ausencia de infección. VP: probabilidad que un individuo con resultado (+) esté realmente infectado (VP+) o de que un individuo con resultado (-) sea realmente no infectado (VP-). Las dos primeras son intrínsecas del método, en cambio el VP depende de la prevalencia de la infección. Así, en zona de alta endemicidad el VP+ de un resultado positivo es más alto que en una zona no endémica (y por lo tanto la probabilidad de resultado falso positivo es menor).

36 Como ningún método tiene 100% de E, las pautas para diagnóstico de la infección chagásica (Manual para la atención del paciente infectado con Trypanosoma cruzi. Ministerio de Salud de la Nación. 2005) determinan que, para que un individuo sea considerado chagásico, deben dar positivos al menos dos métodos serológicos diferentes: ELISA + HAI ELISA + IF HAI + IF Como ningún método tiene 100% de E, las pautas para diagnóstico de la infección chagásica (Manual para la atención del paciente infectado con Trypanosoma cruzi. Ministerio de Salud de la Nación. 2005) determinan que, para que un individuo sea considerado chagásico, deben dar positivos al menos dos métodos serológicos diferentes: ELISA + HAI ELISA + IF HAI + IF

37 Actualmente, la reacción más sensible es ELISA que, por otra parte, si se cuenta con un espectrofotómetro de lectura vertical (lector de ELISA), tiene la ventaja de la objetividad. Permite procesar elevado número de muestras. Actualmente, la reacción más sensible es ELISA que, por otra parte, si se cuenta con un espectrofotómetro de lectura vertical (lector de ELISA), tiene la ventaja de la objetividad. Permite procesar elevado número de muestras.

38 La prueba de HAI tiene la ventaja de permitir la titulación del nivel de anticuerpos con rapidez y sencillez operativa y también es adecuada para procesamiento de elevado número de muestras. La prueba de HAI tiene la ventaja de permitir la titulación del nivel de anticuerpos con rapidez y sencillez operativa y también es adecuada para procesamiento de elevado número de muestras.

39 Respecto a la IF, sin dudas se trata de una buena metodología, pero requiere experiencia del operador y depende de la subjetividad del mismo. Por otra parte, el equipamiento requerido no está al alcance de pequeños laboratorios y no es una técnica adecuada para procesar elevado número de muestras. Respecto a la IF, sin dudas se trata de una buena metodología, pero requiere experiencia del operador y depende de la subjetividad del mismo. Por otra parte, el equipamiento requerido no está al alcance de pequeños laboratorios y no es una técnica adecuada para procesar elevado número de muestras.

40 EN UN LABORATORIO DEBEN ESTAR DISPONIBLES AL MENOS DOS PRUEBAS, DE ACUERDO A LA COMPLEJIDAD DEL MISMO, LA INFRAESTRUCTURA DISPONIBLE Y LA FORMACION PROFESIONAL. EN UN LABORATORIO DEBEN ESTAR DISPONIBLES AL MENOS DOS PRUEBAS, DE ACUERDO A LA COMPLEJIDAD DEL MISMO, LA INFRAESTRUCTURA DISPONIBLE Y LA FORMACION PROFESIONAL.

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