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Trabajo Práctico Observación de vectores. Estudios Parasitológicos Floridia Ricardo Ariel 2012.

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1 Trabajo Práctico Observación de vectores. Estudios Parasitológicos Floridia Ricardo Ariel 2012

2 Estudios Parasitológicos

3 Sensibilidad de métodos El laboratorio en el diagnóstico de la infección chagásica Dra. Beatriz Basso

4 Búsqueda de Tripanosoma cruzi en insecto vector Identificar si se trata de un insecto de la subfamilia Triatominae (posible transmisor de la enfermedad de Chagas – Mazza Tomar el insecto con la pinza

5 Búsqueda de Tripanosoma cruzi en insecto vector Liberar el contenido intestinal. Con dos pinzas Precauciones. Guardapolvo, guantes, gafas y vidrio protector. Observar al microscopio a 40x

6 Búsqueda de Tripanosoma cruzi en insecto vector

7 Xenodiagnóstico Considerado el método de referencia Sensibilidad: En formas agudas entre 85 al 100%, en las congénitas 80% y en las crónicas entre el 20 al 50%. Las cajas están compuestas por ninfas de 3 o a 4 o estadio, con algunas semanas de ayuno (2 a 3) y ávidas de alimentarse. Se colocan alrededor de 10 a 12 ninfas dentro de una caja, con una boca libre, cubierta con gasa; se utilizan 4 de estas cajas sobre la piel de los antebrazos.

8 Xenodiagnóstico Observar contenido intestinal a los 30, 60 y 90 días de la succión de sangre. Se busca tripomastigotes o epimastigotes en el contenido intestinal.

9 Método Strout Es el método de preferencia en la etapa aguda (hasta los 40 – 60 días post infección). Reconocer la movilidad de los parásitos entre los hematíes Se debe repetir en forma seriada (3 veces) También se utiliza para control de tratamiento. Para informar un Strout como positivo debemos observar la movilidad del parásito. IMPORTANTE: observar recorriendo todos los campos (no menos de 45 minutos ) y varios preparados

10 Sensibilidad 95% 5-10 mL Tº amb Coag. 600 rpm 2 min rpm 10 min. Suero Sedimento Objetivos de 10x y 40x (45 minutos)

11 Micrométodo de Strout Se utiliza un tubo Eppendorf de 1,5 ml de capacidad al que se le agrega una gota de heparina más 0,5 ml de sangre venosa, se mezcla por inversión Centrifugar durante dos minutos a 3000 rpm. Tomar una gota de la interfase, rica en glóbulos blancos, y se observa entre porta y cubreobjeto al microscopio con 400 aumentos. Deben observarse como mínimo 4 preparados. Sensibilidad similar al Strout Reducción de cantidad de sangre a extraer. Medicina Vol 59 Supl III – 1999 De Rissio, AM; Maidana,CG; Martín García, MC y Ruiz, AM INPDr. Mario Fatala Chabén

12 Microhematocrito Para diagnóstico durante la etapa aguda o en los casos congénitos. Es importante extraer 6 o mas tubos capilares (50 ul c/u) Sensibilidad semejante a strout Observar varios preparados con las consideraciones del strout Inconvenientes técnicos. Bioseguridad J Clin Microbiol August; 18(2): H Feilij, L Muller and S M Gonzalez Cappa

13 Sensibilidad 90 a 95% 45 segundos a 5000 rpm 6 a 9 microhematocrito heparinizado Cerrar extremo con plastilina Cortar BIOSEGURIDAD Objetivos de 10x y 40x (45 minutos)

14 Gota fresca Método que se puede efectuar en la etapa aguda De fácil realización De baja sensibilidad Observar movilidad de los parásitos.

15 Aumentar irrigación Sensibilidad 50% 100x / 400x gota de citrato al 2%) Tripanosoma cruzi 45 minutos

16 Gota gruesa Método sencillo Baja sensibilidad Observar morfología del parásito

17 Sensibilidad 50% Colocar 1 a 3 gotas Desfibrinar 1-2min Dejar secar Colorear con Giemsa diluido (1/20) 30 minutos. Lavar y secar objetivo de 100x aceite Tripanosoma cruzi

18 Hemocultivo Consiste en sembrar una muestra de sangre en un medio de cultivo artificial y amplificar el número de parásitos. Como producto del cultivo se obtienen epimatigotes de T. cruzi. Es aplicable a la etapa aguda pero también en la crónica, en la cual disminuye en gran medida la sensibilidad. Requiere de un tiempo prolongado para obtener resultados. Se puede realizar una coloración (Giemsa) para visualizar el tripanosoma con mayor definición.

19 Sensibilidad: Agudo: 80 – 100% Crónico:40 – 60% Se incuba sangre heparinizada a 28ºC hasta 60 días

20 PCR para Chagas No está validad (solo para seguimiento de tratamiento) Tiene elevada sensibilidad (aún en etapa crónica) Falsos positivos y algunos falsos negativos. Selectivo para T. cruzi y T. rangeli Amplifica un fragmento de 330 pb del ADN k Mix p/1x30: 30ul H2O: 12,7 ul Buffer (10x) Taq: 3 ul MgCl2 (25mM): 3,6 ul dNTPs (5mM): 1,5 ul Primer 121 (50pmol/ml): 1,5 ul Primer 122 (50pmol/ml): 1,5 ul Taq (0,8ul/20ul): 1,2 ul TOTAL: 25 ul (1x25ul) 25ul mix + 5 ul (muestra)

21 PCR para Chagas

22 Bibliografía Manual de procedimientos de laboratorio para el diagnóstico de la Trypanosomiosis americana (enfermedad de Chagas). Serie de Normas Técnicas Nº 00. Lima, 2005 Fortalecimiento en la Enseñanza de la Enfermedad de Chagas Diagnóstico de Laboratorio Dra. Beatriz Basso* * Profesora, Servicio de Neonatologia, Cátedra de Pediatría y Neonatología. Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Córdoba Universidad Nacional de Córdoba Parasitosis regionales. Un estudio referido a las principales parasitosis de Bahía Blanca, Provincia de Buenos Aires, Argentina. Sixto Raúl Costamagna, Elena C. Visciarelli. Parasitosis Humanas. David Botero Marcos Restrepo. Tercera edición La enfermedad de Chagas. A la puerta de los 100 años del conocimiento de una endemia americana ancestral. Manual Práctico de Parasitología Médica. Dra. Nélida G. Saredi Clave pictórica de triatóminos (Hemiptera: Triatominae) de Venezuela. Ana Soto-Vivas. Boletín de Malariología y Salud Ambiental. Vol. XLIX, Nº 2, Agosto- Diciembre, 2009 Aspectos exocoriales de huevos de Triatoma patagonica Del Ponte, 1929 por microscopía electrónica de barrido Elena VisciarelliI; Adriana FerreroII; Sixto Raúl CostamagnaI. Departamento de Biología, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional del Sur, San Juan 670, 8000 Bahía Blanca, Prov. de Buenos Aires, Argentina. ICátedra de Parasitología Clínica. IICátedra de Zoología de Invertebrados II Las especies de Triatominae de mayor adaptación al hombre, tratadas en este trabajo. Hipotesis sobre el desarrollo de la Trypanosomiasis Americana - Carpintero, D. J. y Viana, E.J. Buenos Aires, Argentina Alimentación y defecación en triatominos del género Rhodnius (Hemiptera: Reduviidae) alimentados con sangre humana. E. Aldana E.Lizano M.Rodríguez A. Valderrama. Recibido 28-IV Corregido 20-XI Aceptado 20-XI-2000 Ecología de la enfermedad de Chagas, y su prevención y control en la Amazonia. Un enfoque de ecosalud. Roberto Bazzani, IDRC/CRDI; Roberto Salvatella, OPS/OMS La aerotermia como alternativa para el control de Triatoma infestans (Hemiptera, Reduviidae) resistentes a deltametrina. Alberto G. GentileI; José L. SartiniII; María C. CamposIII; Juan F. SánchezIV. ICoordinación de Gestión Epidemiológica, Ministerio de Salud Pública, Salta, Argentina Diagnóstico Molecular de la enfermedad de Chagas. Constança Britto. Laboratorio de Biología Molecular y Enfermedades Endémicas, Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz, , Río de Janeiro, RJ, Brasil. Correo electrónico: Utilidad de la técnica de PCR. en el diagnóstico de la enfermedad de Chagas. Brusés, Bettina L. - Lucero, Horacio - Gorodner, Jorge O. Departamento de Biología Molecular - Instituto de Medicina Regional - UNNE.


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