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Epidemiologia serológica Integrantes: Escobar Martin, Jimena Torres Franklin, María del Pilar.

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1 Epidemiologia serológica Integrantes: Escobar Martin, Jimena Torres Franklin, María del Pilar

2 Definición: Consiste en investigar la enfermedad y la infección en las poblaciones mediante la valoración de variables presentes en el suero sanguíneo. Consiste en investigar la enfermedad y la infección en las poblaciones mediante la valoración de variables presentes en el suero sanguíneo. Uno de los principales componentes del suero que suele analizarse es la actividad de las globulinas como anticuerpos específicos. Uno de los principales componentes del suero que suele analizarse es la actividad de las globulinas como anticuerpos específicos. Si los valores siguen una distribución normal, o esta transformación puede llevarse a cabo, puede aplicarse una prueba-t de Student para una sola muestra. Si los valores siguen una distribución normal, o esta transformación puede llevarse a cabo, puede aplicarse una prueba-t de Student para una sola muestra.

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4 Valoracion de anticuerpos M étodos para expresar las tasas de anticuerpos La concentración de los anticuerpos se expresa en forma de título. La concentración de los anticuerpos se expresa en forma de título. El título es la dilución más alta del suero que produce reacción al aplicar una técnica. El título es la dilución más alta del suero que produce reacción al aplicar una técnica. Animales seropositivos: títulos detectables de anticuerpos. Animales seropositivos: títulos detectables de anticuerpos. Animales seronegativos: no tienen anticuerpos detectables. Animales seronegativos: no tienen anticuerpos detectables. Sero-conversión: animales que eran seronegativos y ahora son seropositivos. Sero-conversión: animales que eran seronegativos y ahora son seropositivos.

5 Transformación logarítmica de títulos El suero se diluye siguiendo una serie geométrica. La relación más común es 2. El suero se diluye siguiendo una serie geométrica. La relación más común es 2. Así, el suero se diluye ½, ¼, 1/8, 1/16, 1/32... Así, el suero se diluye ½, ¼, 1/8, 1/16, 1/32... Los títulos deberían valorarse en una escala logarítmica porque: Los títulos deberían valorarse en una escala logarítmica porque: La distribución de frecuencias de los títulos suele ser lognormal. La distribución de frecuencias de los títulos suele ser lognormal. Las series de dilución geométrica presentan el mismo espaciado en una escala logarítmica. Las series de dilución geométrica presentan el mismo espaciado en una escala logarítmica.

6 Distribución lognormal

7 La dilución puede codificarse como el valor de estos logaritmos en base 2 INVERSA DE LA DILUCIÓN (X) TÍTULO CODIFICADO (LOG 2 X) 1 (suero no diluido)

8 Títulos medios Si se registran varios títulos codificados, puede calcularse su media aritmética. Si se registran varios títulos codificados, puede calcularse su media aritmética. La suma de los títulos codificados entre el número de títulos. La suma de los títulos codificados entre el número de títulos. Ejm: hay 5 títulos: ½, ¼, ½, 1/8 y ¼. los títulos codificados son: 1, 2, 1, 3 y 2 respectivamente. media aritmética: ( )/

9 Título medio geométrico (TGM) Es el antilogaritmo en base 2 de la media codificada. Es el antilogaritmo en base 2 de la media codificada. Ejm: Si la media aritmética de varios títulos codificados es 4.7 : el log 2 TGM : 4.7 el TGM :

10 Aplicando log10: Aplicando log10: log10 TGM : 4.7 X log X Antilog : 26 el TGM es 26

11 Si se ha comenzado con una dilución log10 y después se han realizado diluciones log2: Si se ha comenzado con una dilución log10 y después se han realizado diluciones log2: Ejm: se tienen las siguientes diluciones: 1/10, 1/20, 1/40 y 1/80 serían codificados como 0, 1, 2, 3; y la media es 1.5 Entonces: TGM/10 = TGM/10 = log10(TGM/10) = 1.5 X = 0.45 TGM/10 = antilog 0.45 TGM/10 = antilog 0.45 = 2.8 el TGM es 28 = 2.8 el TGM es 28 EL TÍTULO MEDIO SOLAMENTE PUEDE CALCULARSE CON ANIMALES SEROPOSITIVOS

12 Ensayo cuantal Mide una respuesta del tipo todo o nada. Mide una respuesta del tipo todo o nada. Existen dos distemas que se utilizan: Existen dos distemas que se utilizan: Ensayo de dilución seriada simple Ensayo de dilución seriada simple Es el más común; cada dilución se valora una sola vez Es el más común; cada dilución se valora una sola vez Ensayo de dilución seriada múltiple Ensayo de dilución seriada múltiple Cada dilución se valora varias veces (al menos cinco); el punto límite es cuando un número de miembros del grupo de prueba muestra un efecto definido como la muerte enfermedad. Cada dilución se valora varias veces (al menos cinco); el punto límite es cuando un número de miembros del grupo de prueba muestra un efecto definido como la muerte enfermedad.

13 Ejemplo de titulación por el método de Spearman-Karber Tabla 16.3 Ejemplo de una titulación límite 50%

14 FÓRMULA Log DE 50 = L – d(ΣP – 0.5) Log DE 50 = L – d(ΣP – 0.5) Donde: Donde: L : log de la dilución más alta a la que todos los tapices quedan intactos. L : log de la dilución más alta a la que todos los tapices quedan intactos. d : log del factor de dilución (es decir, la diferencia entre el log de los intervalos de dilución). d : log del factor de dilución (es decir, la diferencia entre el log de los intervalos de dilución). ΣP : suma de la proporción de pruebas positivas (es decir, tapices intactos) comenzando en la dilución más alta que presenta un resultado positivo. ΣP : suma de la proporción de pruebas positivas (es decir, tapices intactos) comenzando en la dilución más alta que presenta un resultado positivo.

15 Según la tabla 16.3: Según la tabla 16.3: L = 0.6 L = 0.6 d = log 10 2 = 0.3 d = log 10 2 = 0.3 ΣP = = 3.20 ΣP = = 3.20 Así: log DE 50 = {0.3( )} Así: log DE 50 = {0.3( )} = -0.6 – (0.3 x 2.7) = -0.6 – 0.8 = -1.4 Por tanto DE 50 = antilog (-1.4) = 1/(25.1) = 1/(25.1) Entonces: 0.1 ml de suero contienen 25.1 DE 50 y 1 ml contiene 251 DE 50.

16 Error estandar estimado (e.e.e.) e.e.e (log 10 ED 50 ) = d P(1-P) /(n – 1) e.e.e (log 10 ED 50 ) = d P(1-P) /(n – 1) Donde: Donde: n: número de animales en cada grupo n: número de animales en cada grupo Log 10 e.e.e. = Log 10 e.e.e. = = 0.3 (0.8x0.2)+(0.8x0.2)+(0.4x0.6)+(0.2x0.8) / (5-1) (5-1) = 0.3 ( )/4 = 0.3 ( )/4 = 0.13 Por tanto, el título puede expresarse como: DE 50 por 1/10 ml ó DE 50 por ml

17 Estimaciones y comparaciones serológicas en las poblaciones Detección de la presencia de anticuerpos: Detección de la presencia de anticuerpos: Los animales se clasifican como positivos o negativos. El que una prueba detecte o no anticuerpos, depende no solo de la exposición al antígeno sino también de la técnica en detectarlos. Los animales se clasifican como positivos o negativos. El que una prueba detecte o no anticuerpos, depende no solo de la exposición al antígeno sino también de la técnica en detectarlos.

18 Comparación de tasas de anticuerpos Comparación entre dos poblaciones diferentes: Comparación entre dos poblaciones diferentes: Se puede utilizar la prueba X2 Se puede utilizar la prueba X2 Para pruebas independientes se utiliza la prueba-t de Student. Para pruebas independientes se utiliza la prueba-t de Student. Comparación de diferentes estimaciones de la misma población: Comparación de diferentes estimaciones de la misma población: Se puede realizar una comparación aceptable utilizando una prueba t. Se puede realizar una comparación aceptable utilizando una prueba t.

19 Interpretación de las pruebas serológicas Exactitud: Exactitud: Los agentes infecciosos presentan diversos antígenos en su superficie y en su interior. Los agentes infecciosos presentan diversos antígenos en su superficie y en su interior. Un tipo de técnica no siempre es más exacto que otro. Un tipo de técnica no siempre es más exacto que otro. La exactitud también depende de la naturaleza del antígeno que se emplea en la técnica. La exactitud también depende de la naturaleza del antígeno que se emplea en la técnica.

20 SEGURIDAD PUEDEN EXISTIR FALSOS POSITIVOS Y FALSOS NEGATIVOS. Causas de los resultados positivos y negativos en las tecnicas serológicas.

21 Resultados positivos Un resultado positivo verdadero es consecuencia de una infección real. Los falsos positivos se producen por diversas razones: Los falsos positivos se producen por diversas razones: - Reacciones cruzadas de grupo: entre un agente infeccioso y anticuerpos frente a distintos microorganismos con antígenos similares. - Inhibidores no específicos: estos imitan los efectos de los anticuerpos en ausencia de los mismos.

22 Resultados negativos Un resultado negativo verdadero indica ausencia de infección. Pueden producirse falsos negativos por diversos motivos: Pueden producirse falsos negativos por diversos motivos: - Tolerancia natural o inducida - Momento inapropiado - Técnicas inadecuadas - Inhibidores no específicos - Anticuerpos incompletos Anticuerpos bloqueantes Anticuerpos bloqueantes Técnica demasiado insensible Técnica demasiado insensible

23 RELACION ENTRE SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD El grafico de la parte superior representa la distribución de frecuencias de una variable en una población sana. El grafico de la parte superior representa la distribución de frecuencias de una variable en una población sana. El grafico inferior representa la distribución de frecuencias en una población afectada. El grafico inferior representa la distribución de frecuencias en una población afectada.

24 Cuando se estudia una gran parte de una población para detectar una enfermedad la interpretación de la prueba se dirige hacia una mayor sensibilidad en disminución de la especificidad. Cuando se estudia una gran parte de una población para detectar una enfermedad la interpretación de la prueba se dirige hacia una mayor sensibilidad en disminución de la especificidad. Las pruebas iniciales no buscan diagnósticos definitivos, su objetivo es detectar tantos casos como sea posible. Las pruebas iniciales no buscan diagnósticos definitivos, su objetivo es detectar tantos casos como sea posible. Obtener mayor cantidad de falsos positivos no es tan critico como obtener una alta proporción de falsos negativos. Obtener mayor cantidad de falsos positivos no es tan critico como obtener una alta proporción de falsos negativos.

25 VALOR PREDICTIVO DE LAS TECNICAS SEROLOGICAS CALCULO DEL VALOR PREDICTIVO CALCULO DEL VALOR PREDICTIVO Al utilizar técnicas serológicas u otras técnicas de selección para determinar la presencia de una enfermedad en una población es importante saber si los animales positivos son realmente positivos y que los animales negativos son realmente negativos según la técnica empleada. Estas probabilidades son los valores predictivos de la técnica. Depende de la sensibilidad, especificidad y prevalencia. Depende de la sensibilidad, especificidad y prevalencia.

26 Pτ = proporción de animales afectados según la técnica en una población P = prevalencia real

27 Si se conoce la sensibilidad y la especificidad de la técnica se puede realizar una estimación corregida de la verdadera prevalencia P P = P τ + especificidad -1. P = P τ + especificidad -1. Sensibilidad + especificidad -1 Sensibilidad + especificidad -1 El valor predictivo (resultado positivo de la prueba) viene dado por: P x sensibilidad. P x sensibilidad. P x sensibilidad (1 - P) x (1 - especificidad)

28 Esta tabla se clasifica en verdaderos y falsos positivos y negativos: Sensibilidad = a/(a + c) Especificidad = d/(b + d) Valor predictivo (resultado positivo)= a/(a + b) Valor predictivo (resultado negativo)= d/(c + d)

29 PREVALENCIA DE ANTICUERPOS VIDA MEDIA La presencia de anticuerpos detectables indica que o un animal o su madre han estado expuestos al antígeno que estimula la producción de estos anticuerpos. En ausencia de un contacto posterior, el nivel de anticuerpos disminuirá. La tasa de esta disminución valorada como vida media de los anticuerpos varia para cada tipo de anticuerpos. La prevalencia de los anticuerpos detectables depende de la tasa de infección, de la tasa de supervivencia de los anticuerpos y del momento en que las tasas citadas han sido efectivas.

30 REPETITIBILIDAD Esta depende de diversos factores incluyendo el grado de estandarización de los reactivos y la experiencia del técnico que las realiza.

31 BANCOS DE SUERO Un banco de suero es una colección catalogada de sueros que constituye una muestra aleatoria y lo mas representativa posible de una población y que se mantiene para preservar sus características inmunológicas y bioquímicas.

32 APLICACIONES DE LOS BANCOS DE SUERO Un banco de suero puede ser de ayuda en los siguientes objetivos en relación con las enfermedades infecciosas. 1.Identificación de problemas sanitarios principales 2.Establecimiento de prioridades de vacunación 3.Demarcación de la distribución de las enfermedades 4.Investigación de enfermedades descubiertas recientemente 5.Determinación de la periodicidad de las epidemias 6.Un incremento del conocimiento sobre la etiología de las enfermedades. 7.Evaluación de las campañas de vacunación 8.Estimación de las perdidas económicas atribuibles a la enfermedad.

33 PROCEDENCIA DE LOS SUEROS Estas son las posibles fuentes de suero y algunas características. La precisión de los resultados obtenidos de un banco de sueros depende de: - La sensibilidad y la especificidad de la técnica aplicada a los sueros. - La calidad del protocolo seguido en la recogida del suero - El grado de deterioro sufrido por los sueros durante su almacenamiento.

34 RECOGIDA Y CONSERVACION DE SUEROS RECOGIDA La muestra debe ser tomada asépticamente. La muestra debe ser tomada asépticamente. Debe dejarse coagular de 1-2 horas a temperatura ambiente. Debe dejarse coagular de 1-2 horas a temperatura ambiente. Mantenerse toda la noche en posición horizontal a 4°C. Mantenerse toda la noche en posición horizontal a 4°C. Luego separar el suero por centrifugación Luego separar el suero por centrifugación La sangre también puede recogerse en discos de papel de filtro, y luego extraerse el suero, aunque la cantidad va a ser menor y solo se permiten estudios semicuantitativos. La sangre también puede recogerse en discos de papel de filtro, y luego extraerse el suero, aunque la cantidad va a ser menor y solo se permiten estudios semicuantitativos.

35 CONSERVACION La reactividad de los anticuerpos a las técnicas serológicas se puede ver afectado por un almacenamiento prolongado. Existen dos técnicas de conservación: ultra congelación y liofilización. Ultra congelación: Fase liquida de nitrógeno liquido: -196°C. Fase liquida de nitrógeno liquido: -196°C. Fase de vapor de nitrógeno liquido: -110°C. Fase de vapor de nitrógeno liquido: -110°C. Ultra congelación: -70°C a -90°C Ultra congelación: -70°C a -90°C Ultra congelación estándar: -20 a -40°C Ultra congelación estándar: -20 a -40°C La conservación prolongada a -20°C puede permitir el deterioro de los anticuerpos.

36 Liofilización: Mejor que la ultra congelación. Mejor que la ultra congelación. Relativamente cara y compleja Relativamente cara y compleja Debe tenerse en cuenta lo siguiente : Debe tenerse en cuenta lo siguiente : Conservación prolongada de anticuerpos puede producir la perdida de anticuerpos específicos. Conservación prolongada de anticuerpos puede producir la perdida de anticuerpos específicos. Congelación y descongelación repetidas tiene efectos deletéreos. Congelación y descongelación repetidas tiene efectos deletéreos. Utilización de crioprotectores y/o enzimas inhibidoras reduce el deterioro. Utilización de crioprotectores y/o enzimas inhibidoras reduce el deterioro. Necesaria la congelación rápida de las muestras. Necesaria la congelación rápida de las muestras. Importante = Esterilidad. Importante = Esterilidad. Muestras deben analizarse inmediatamente después de su descongelación. Muestras deben analizarse inmediatamente después de su descongelación. Todo retraso conduce a un aumento de la tasa de proteolisis. Todo retraso conduce a un aumento de la tasa de proteolisis.

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