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Introducción a La Apoptosis Introducción a La Terapia Génica Curso 2008-09.

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1 Introducción a La Apoptosis Introducción a La Terapia Génica Curso

2 Introducción a La Apoptosis Concepto Mecanismos moleculares: –Inducción –Control –Ejecución Implicaciones: –Función fisiológica –Implicaciones patológicas

3 Introducción a La Apoptosis Concepto Mecanismos moleculares: –Inducción –Control –Ejecución Implicaciones: –Función fisiológica –Implicaciones patológicas

4 Kerr, J.F.R., Wyllie, A.H. & Currie, A.R. Apoptosis: A Basic Biological Phenomenon With Wide Ranging Implications In Tissue Kinetics British Journal of Cancer (1972), 26: 239.

5 ¿Qué Es La Apoptosis? ª Caída de la hoja (Kerr et al., 1972). ª Suicidio celular. Autodestrucción de las células, activa y genéticamente controlada, caracterizada por una morfología específica.

6 Apoptosis Necrosis Necrosis: –Tipo de muerte celular, que ocurre como consecuencia de un daño masivo de tejido, asociada con una rápida incapacitación de las principales funciones celulares como son la expresión génica, síntesis de ATP y potencial de membrana.

7 Apoptosis versus Necrosis ApoptosisNecrosis Causas Falta factores crecimiento Influencia hormonal Toxicidad suave Anoxia Daño físico o químico Morfología Cel. EncogidaCel. Inflada Núcleo Condensación, segmentación, fragmentación ADN Degradación ADN Membrana celular Protuberancias, cambios en la distribución de fosfatidilserina Lisa, lisis Mitocondria Cambios molecularesInflamiento Expresión + Expresión génica, síntesis proteica, activación proteasas -

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9 Website designed by Phil Dash: ~dash/apoptosis/intro.html Apoptosis de una célula trofoblástica:

10 Introducción a La Apoptosis Concepto Mecanismos moleculares: –Inducción –Control –Ejecución Implicaciones: –Función fisiológica –Implicaciones patológicas

11 Mecanismos Moleculares Caenorhabditis elegans: –Adulto: 1090 células somáticas 131 mueren por apoptosis –Básicamente, 4 genes mayores controlan la MCP (ced = cell death defective): Mutaciones en egl-1, ced-3 y ced-4: células sobreviven (promotores de MCP) Mutación en ced-9: aumenta la apoptosis (inhibidor) –Genes homólogos en mamíferos

12 Proteinas Apoptóticas En C. elegans Hengartner, M. (1998) Science 281:

13 Genes Homólogos En Mamíferos Adams, J & Cory, S. (1998) Science 281:

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16 Introducción a La Apoptosis Concepto Mecanismos moleculares: –Inducción –Control –Ejecución Implicaciones: –Función fisiológica –Implicaciones patológicas

17 Inducción De La Apoptosis Interacciones ligando-receptor. Estrés celular: –Químicos, –Radiaciones, –Infecciones virales. Linfocitos T citotóxicos (granzima). ~dash/apoptosis/intro.html

18 1. Interacción Ligando- Receptor Death receptors (Superfamilia de TNF): –CD95 (Fas) –TNFR1 –TRAIL (TNF related apoptosis inducing ligand): DR4 y DR5

19 Inducción Vía CD95/Fas Muerte celular mediada por las células T citotóxicas. Respuesta inmune: supresión de células T activadas. Sitios inmunoprivilegiados: destrucción de células inmunes e inflamatorias. ~dash/apoptosis/intro.html DISC

20 Inducción Vía TNFR1 TNF se produce por células T y Macrófagos activados en respuesta a la infección. –Activación de NF- B y AP-1 Inducción de genes proinflamatorios (1). –Inducción de apoptosis (2) 1 2 ~dash/apoptosis/intro.html

21 Inducción Vía TRAIL Acción similar a CD95. Unión a receptores DR4 y DR5. Expresión constitutiva en muchos tejidos Mecanismos de protección celular mediante la expresión de receptores señuelo DcR1 y DcR2.

22 2. Estrés celular: Daño genotóxico Agentes intercalantes (Cisplatin, mytomicin C, formaldehyde). Inductores de aductos al ADN (Polycyclic aromatic hydrocarbons: benzo(a)pyrene). Agente alquilante (ethyl Methanesulphonate, n-ethyl-n- nitrosurea). Productores de radicales libres (Niquel, arsenic, H 2 O 2 ). Inhibidores de microtúbulos (Taxol). Inhibidores de la Topoisomerasa (Etoposide, doxorubicin). Perturbadores del balance nucleotídico (methotrexate). Radiaciones (x-ray).

23 Proteína de unión al ADN con dominios de activación de la trascripción. Previene la replicación del ADN dañado. Supresor tumoral. Mutaciones de p53 en el 50% de los tumores humanos (60-70% cancer asociados al ambiente). p53: El Guardián Del Genoma Lane (1992)

24 Funciones De p53 ADN dañadoATMp53 P MDM 1. Parada del ciclo celular: p21 p53P Cdk2 S phase (DNA synthesis) G2G2 G1G1 M 2a. ADN reparado: ATM p53 MDM 2b. Apoptosis: Bax, Fas/FasL Bcl-2

25 Regulación De p53 Stanchina et al. (1998) Genes and Development 12: MDM

26 3. Linfocitos T Citotóxicos

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28 Introducción a La Apoptosis Concepto Mecanismos moleculares: –Inducción –Control –Ejecución Implicaciones: –Función fisiológica –Implicaciones patológicas

29 Función de la Mitocondria Localización de miembros de la familia de Bcl-2 en la membrana mitocondrial. Promover o prevenir la formación de poros en la membrana controlando la liberación de citocromo C. ~dash/apoptosis/intro.html

30 Familia de Bcl-2 Homólogos a las proteínas ced-9 y egl-1. Miembros pro- y anti-apoptóticos Adams, J & Cory, S. (1998) Science 281:

31 Estructura proteica Formación de homo- y hetero-dímeros. Similar a las proteínas de formación de poros bacterianas. Dominios de unión a membrana en el extremo C terminal. Localización en la membrana externa mitocondrial. Adams, J & Cory, S. (1998) Science 281:

32 Regulación de la apoptosis por la familia de Bcl-2 Liberación de Cyt C Adams, J & Cory, S. (1998) Science 281: Activación de caspasas

33 Regulación de la apoptosis por la familia de Bcl-2 La sensibilidad de la célula a un estímulo apoptótico depende del balance entre miembros pro y anti-apoptóticos. Estímulo apoptótico Bax Bcl-2 Cyt C

34 Regulación de la apoptosis por la familia de Bcl-2 Modelos de control de apoptosis: A Bcl-2 Bax B Bcl-2 C BaxBcl-2 Chau, D.T. & Korsmeyer, S.J. (1998) Annual Review in Immunology 16: A + B+ C

35 Regulación de la apoptosis por la familia de Bcl-2 Regulación post-traducción: BH3 only Chau, D.T. & Korsmeyer, S.J. (1998) Annual Review in Immunology 16: PI3-K AKT

36 Regulación de la apoptosis por la familia de Bcl-2 Regulación post-traducción: BH3 only Caspasa-8 Bid Desagher et al. (1999) JBC 144:

37 Introducción a La Apoptosis Concepto Mecanismos moleculares: –Inducción –Control –Ejecución Implicaciones: –Función fisiológica –Implicaciones patológicas

38 Familia De Caspasas Homólogos a ced-3. Cystein proteasas (Cys en su sitio activo). Ampliamente expresadas en forma de proenzimas. Digestión de proteínas en los residuos de ácido aspártico.

39 Clases De Caspasas Iniciadoras (like caspasa-9) Ejecutoras (like Caspasa-3) –Digestión de proteínas –Cambios morfólogicos celulares. Thornberry, N.A.. & Lazebnik, Y. (1998) Science 281:

40 CaspasaNombre alternativo SubstratoFunción Caspasa-1 ICEpre-Interleukin-1b Interleukin-18 Lamins Processing of interleukins (inflammation). Can also induce apoptosis depending on isoform and if overexpressed. Caspasa-2 Ich-1 (human), Nedd2 (rat, mouse) Golgin-160 Lamins (?) Apoptosis (activity supressed by serum deprivation) Caspasa-3 CPP32, Yama, apopain PARP SREBs Gelsolin Caspase-6 Caspase-7 Caspase-9 DNA-PK MDM2 Gas2 Fodrin -Catenin Lamins NuMA HnRNP proteins Topoisomerase I FAK Calpastatin p21 Waf1 Presenelin2 ICAD Apoptosis

41 CaspasaNombre alternativo SubstratoFunción Caspasa-4 Ich-2, ICE rel IICaspase-1Inflammation/Apoptosis (note: this could be the human form of mouse caspase-11). Related to human caspase-5 and caspase-1 Caspasa-5 ICE rel III, TY?Inflammation/Apoptosis (related to human caspase-4 and caspase-1) Caspasa-6 Mch2PARP Lamins NuMA FAK Caspase-3 Keratin-18 Apoptosis Caspasa-7 Mch3, ICE-LAP3, CMH-1 PARP Gas2 SREB1 EMAP II FAK Calpastatin p21 Waf1 Apoptosis (activity blocked by cIAP1 and cIAP2) Similar in structure and substrate specificity to caspase-3

42 CaspasaNombre alternativo SubstratoFunción Caspasa-8 FLICE, MACH, Mch5Caspase-3 Caspase-4 Caspase-6 Caspase-7 Caspase-9 Caspase-10 Caspase-13 PARP Bid Apoptosis (death receptors) Caspasa-9 Apaf-3, ICE-LAP6, Mch6 Caspase-3 pro-Caspase-9 Caspase-7 PARP Apoptosis Caspasa-10 FLICE-2, Mch4Caspase-3 Caspase-4 Caspase-6 Caspase-7 Caspase-8 Caspase-9 Apoptosis (death receptors) Caspasa-11 Ich-3, ICE_B?Murine caspase similar to human caspase-4. Belongs to the same family as caspase-3 of enzymes. May be involved in inflammation and apoptosis

43 CaspasaNombre alternativo SubstratoFunción Caspasa-12 ICE_C?Involved in mediating apoptosis following ER stress. Related to mouse caspase-1 and caspase- 11 and human caspase-4 and caspase-5 Caspasa-13 ERICE?Member of the ICE family of caspases that include caspase-1 and caspases- 4, -5 and – 11. Involved in inflammation.

44 Regulación De Las Caspasas Raff, M. (1998) Nature 396: 119

45 Regulación De Las Caspasas Thornberry, N.A.. & Lazebnik, Y. (1998) Science 281:

46 Regulación De Las Caspasas Slee et L. (1999) Jounal of Cell Biology 144:

47 Caspasa-8 Bid Desagher et al. (1999) JBC 144: Regulación De Las Caspasas

48 Efectos De Las Caspasas Thornberry, N.A.. & Lazebnik, Y. (1998) Science 281:

49 Efectos En El Núcleo Inhibición de enzimas de reparación [Poly (ADP- ribosa) polimerasa o PARP]. Inhibición de enzimas de replicación celular (DNA topoisomerasa II). Ruptura de proteínas estructurales nucleares (Caspasa-6 lamina). Fragmentación del ADN.

50 Apoptosis Independiente De caspasas (AIF) AIF (Apoptosis Inducing Factor) se localiza en la mitocondria. Apoptosis: AIF migra al núcleo. AIF se une al ADN y desencadena la destrucción del mismo y la muerte celular. Mecanismo observado en neuronas.

51 Eliminación De Las Células Apoptóticas Pérdida de la asimetría de membrana exposición de la fosfatidil serina en la capa externa

52 Mecanismos moleculares de la apoptosis Terapia Cáncer Enfermedades cardiacas Infartos SIDA Enfermedades autoinmunes Enfermedades neurodegenerativas

53 Introducción a La Apoptosis To be continued...

54 Introducción a La Apoptosis Concepto Mecanismos moleculares: –Inducción –Control –Ejecución Implicaciones: –Función fisiológica –Implicaciones patológicas

55 Implicaciones Función fisiológica: * Desarrollo embrionario * Homeostasia tisular y diferenciación tisular * Respuesta inmune

56 Desarrollo Eliminación de órganos transitorios. Remodelación Tisular. Formación de conexiones neuronales adecuadas. Inhibición de apoptosis mediante señales extrínsecas: –Factores Neurotróficos Supervivencia neuronal. –Factor Stell de las crestas genitales Supervivencia de las células germinales primordiales. –Andrógenos Supervivencia de las células de la próstata.

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58 Respuesta Inmune Selección de células B con anticuerpos de alta afinidad CDF B Apoptosis del 90% de centrocitos Bcl-2

59 Mantenimiento De La Integridad De Sitios inmunoprivilegiados Organos: ojo, oído interno, testículo o cerebro. Expresión de FasL e inducción de apoptosis en linfocitos Fas+. Célula cornea Linfocito Utilización para permitir la tolerancia a transplantes.

60 Eliminación De Células Peligrosas Para La Integridad Del Organismo Células infectadas con virus (CTL). Células del sistema inmune. Células con el ADN dañado. Células cancerosas.

61 Introducción a La Apoptosis Concepto Mecanismos moleculares: –Inducción –Control –Ejecución Implicaciones: –Función fisiológica –Implicaciones patológicas

62 Implicaciones Implicación patológica: * Cáncer * SIDA * Daño tóxico * Enfermedades Neurodegenerativas

63 Apoptosis Y Cáncer

64 Oncogenes / Supresores tumorales Apoptosis Cancer ras c-myc p53Bcl-2 p53* 50% tumores Bcl-2 90% adenocarcinomas colorectales 30-60% cancer de próstata 70% leucemias linfocitarias 20% cancer de pulmón

65 P53 El guardian Del Genoma p53 p53* Carcinógenos genotóxicos radiación - Arresto del ciclo celular en G1 - Inducción de la apoptosis

66 Apoptosis Y Cáncer céls. hematop. epitelios APOPTOSIS CANCER Intestino delgado (stem cells) Colon

67 Iniciación Y Promoción % de las células pretumorales (GST-P+) no desarrollan lesiones observables. apoptosis por promotores tumorales (Fenobarbital, acetato de ciproterona). apoptosis mediante restricción alimentaria

68 Progresión Y Crecimiento Apoptosis: hepatocitos, foci, adenoma, carcinoma Daño genético. Ausencia de factor de supervivencia (mitógenos, hormonas) regresión y potencial eliminación de tumores. !

69 Apoptosis En Tumores ApoptosisProliferación 0.05% 0.5%/h 5%/h Apoptosis Crecimiento < 5% del esperado Higado

70 BaxBcl-2 Bax Bcl-2Bax Bcl-2Bax Quimioterapia Radiación p53 Bcl-2 Bax Apoptosis Inducción de Apoptosis De Células Tumorales

71 Cáncer causado por virus: –HPV: Inactivación de p53 por E6. –Epstein-Barr Virus: Producción de proteína similar a Bcl-2, Incremento en la producción de Bcl-2 celular. Leucemias de células B: traslocación del gen de Bcl-2. Melanoma: Inhibición de la expresión del gen de Apaf-1. Mecanismos De Escape De La Apoptosis

72 Mantenimiento del tumor como un sitio inmunoprivilegiado: – Secreción de moléculas señuelo que se unen a FasL de los CTL. –Expresión de altos niveles de FasL e inducción de la apoptosis de linfocitos T activados. Mecanismos De Escape De La Apoptosis

73 APOPTOSIS Y SIDA

74 Síndrome de Inmuno-Deficiencia Adquirida 1.Infección aguda: Altos niveles de viremia e infección de células CD4+, macrófagos, otras,... Respuesta inmune celular y Ac. 2.Estadío asintomático: Replicación viral/Respuesta inmune celular, Disminución Ac. 3.Estadío sintomático: Disminución de CD4+ y aumento de carga viral. Sintomatología, infecciones oportunista, neoplasias, demencia...

75 Apoptosis de células inmunitarias gp120-gp41 CD4+ Apoptosis: CD8+ Células B NK Granulocitos Monocitos ¿Mecanismo indirecto de inducción de apoptosis? Expresión de altos niveles de FasL

76 Demencia en SIDA Pérdida de neuronas en ganglios basales, materia blanca y corteza cerebral. Infección por HIV de macrófagos, microglia y astrocitos. No neuronas. Actividad neurotóxica: –Proteínas virales: gp120, Tat. –Secreciones de macrófagos y microglía activados: TNF-, excitoxinas, NO


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