Marcación de SONDAS SONDA: secuencia de DNA o RNA marcada y complementaria a un ac. nucleico. SONDA: secuencia de DNA o RNA marcada y complementaria a.

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2 Marcación de SONDAS SONDA: secuencia de DNA o RNA marcada y complementaria a un ac. nucleico. SONDA: secuencia de DNA o RNA marcada y complementaria a un ac. nucleico. La técnica consta de los siguientes pasos: La técnica consta de los siguientes pasos: Extracción del ac. Nucleico Extracción del ac. Nucleico Separación con ER y electroforesis en gel de agarosa Separación con ER y electroforesis en gel de agarosa Blotting a soporte de nitrocelulosa e hibridación con la sonda marcada. Blotting a soporte de nitrocelulosa e hibridación con la sonda marcada. SOUTHERN: SE TRATA EL GEL (de nitrocelulosa) CON HCl PARA DESNATURALIZAR EL ADN, SE NEUTRALIZA CON NaOH Y SE TRANSFIERE A LA MEMBRANA EN SOLUCION DE ALTA FUERZA IONICA SOUTHERN: SE TRATA EL GEL (de nitrocelulosa) CON HCl PARA DESNATURALIZAR EL ADN, SE NEUTRALIZA CON NaOH Y SE TRANSFIERE A LA MEMBRANA EN SOLUCION DE ALTA FUERZA IONICA NORTHERN: NO ES NECESARIO EL TRATAMIENTO, SOLO MANTENER ARN SIN ESTRUCTURA SECUNDARIA NORTHERN: NO ES NECESARIO EL TRATAMIENTO, SOLO MANTENER ARN SIN ESTRUCTURA SECUNDARIA

3 MAS USADAS TECNICAS MAS USADAS OLIGONUCLEOTIDES PROBES OLIGONUCLEOTIDES PROBES NICK – TRANSLATION NICK – TRANSLATION RANDOM PRIMER EXTENSION RANDOM PRIMER EXTENSION α–32P–d NTP, α-35S–d NTP, α–125 I–d NTP: GENERALMENTE d CTP α–32P–d NTP, α-35S–d NTP, α–125 I–d NTP: GENERALMENTE d CTP biotina-11-d UTP, digoxigenina-11-d UTP biotina-11-d UTP, digoxigenina-11-d UTP Marcación de SONDAS

4 La sonda puede ser o no radiactiva y se denominan calientes o frías respectivamente. La sonda puede ser o no radiactiva y se denominan calientes o frías respectivamente. La sensibilidad del ensayo esta dado por la cantidad de secuencia a detectar y la intensidad de la señal La sensibilidad del ensayo esta dado por la cantidad de secuencia a detectar y la intensidad de la señal Actualmente detectan cantidades < nanogramo Actualmente detectan cantidades < nanogramo Marcación de SONDAS

5 Oligonucleotide probes

6 Están involucradas dos enzimas: DNasa 1, DNA polimerasa I. Están involucradas dos enzimas: DNasa 1, DNA polimerasa I. DNA doble cadena para marcar. DNA doble cadena para marcar. La DNAsa I, introduce un nick (Agujero) al azar en una de las cadenas del DNA. La DNAsa I, introduce un nick (Agujero) al azar en una de las cadenas del DNA. La DNA pol I, que posee actividad 5’-3’ exonucleasa: remueve el d NTP del extremo 5’ y el nick se va trasladando. La DNA pol I, que posee actividad 5’-3’ exonucleasa: remueve el d NTP del extremo 5’ y el nick se va trasladando. Se separa el DNA marcado del resto por precipitación con Etanol o columna Sephadex. Se separa el DNA marcado del resto por precipitación con Etanol o columna Sephadex. Nick-Translation

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8 Random Primer Fue Fue descubierto por Feinberg y Volgestein (1986) Secuencia Secuencia de hexanucleotidos aleatorios (Todos los posibles) Fragmento Fragmento Klenow de Pol I (Sin actividad exonucleasa 5`- 3`)

9 Método : Desnaturalización Desnaturalización del dsDNA para obtener ssDNA Añaden Añaden hexanucleotidos y permite emparejamiento Añadir Añadir subunidad Klenow, dCTP y dNTP marcados Obtención Obtención cadena complementaria de DNA marcada

10 Se separa el marcado del resto por precipitación con etanol o columna Sephadex Se separa el marcado del resto por precipitación con etanol o columna Sephadex

11 Nick-Translation Random priming Oligonucleotides Probes

12 Nick-Translation

13 La apoptosis es una forma de muerte celular que se caracteriza por el encogimiento del citoplasma y condensación de la cromatina nuclear. Ello implica la acción de endonucleasas endógenas, lo que se traduce en la degradación del ADN cromosómico y la célula posteriormente se rompe. La aparición de apoptosis en los tejidos se detectaba por métodos, como: (1) Electroforesis en gel de DNA exógeno. (2) Microscopía electrónica, e (3) Histológicamente, evaluando la morfología. Estas técnicas tienen problemas inherentes.

14 “El desarrollo de las técnicas de in situ labelling-end y Nick-translation in situ ha mejorado y facilitó la detección, cuantificación y distribución de la apoptosis a nivel celular en tanto en cultivos celulares y cortes de tejido. Los métodos de in situ labelling-end y Nick-translation se basan en el principio de que las endonucleasas endógenas activadas durante la apoptosis crean mellas (o nicks) en el ADN lo que proporciona un medio por el cual dichas células puede ser detectadas.”

15 “Hemos desarrollado una técnica –Nick-translation dirigido - que permite distingir entre cromosomas X activos e inactivos.” Las regiones activas de la cromatina son estructuralmente distintas de segmentos del genoma que no se transcriben. La conformación de los genes activos hace que sean sensibles a la DNasa I (lo que puede mantenerse incluso en los cromosomas mitótico).

16 Después de Nick-translation: Un cromosoma X activo: Se marca específicamente en las regiones autosómicas y en las regiones X cromosómicas. El cromosoma X inactivo: Se marca sólo en las regiones autosómicas y en una pequeña porción que corresponde a la traducción tardía de los segmentos iniciales de las regiones X. Los cromosomas X están compuestos cada uno por: Las regiones X cromosómicas, y Dos segmentos de característica autosómica que las flanquean. “Nuestra técnica abre la posibilidad de seguir la cinética de inactivación y reactivación del cromosoma X durante la embriogénesis, el estudio de los genes activos o inactivo en el cromosoma X y cartografía de tejidos específicos de grupos de genes.”

17 Random-priming

18 “Ofrece posibilidades únicas de ingeniería para los pequeños péptidos.” levantar unirlos vectores nuevo péptido Se utiliza la técnica de Random- priming para levantar diferentes partes de un gen determinado, luego unirlos y mediante la inserción en vectores expresión se obtiene el nuevo péptido. Las X indican la reciente introducción de mutaciones

19 La técnica permite realizar sustitución de un gran número de aminoácidos (más que por mutagénesis puntual por PCR) Las condiciones para la síntesis por Random-primig pueden ser fácilmente ajustadas para un gen dado.

20 Oligonucleotide probes

21 Las técnicas moleculares se utilizan para estudiar y caracterizar la composición microbiana del queso Fontina Se analizaron muestras de leche, cuajada y queso en diferentes momentos de la maduración sondas de oligonucleótidos La identificación taxonómica, basada en el uso de los sondas de oligonucleótidos para rRNA 16S y 23S, se aplican en experimentos de hibridación de colonias para permitir la identificación de las cepas y para investigar las poblaciones involucradas en producción de Fontina

22 Las especies dominantes: Enteroccocus faecium y Streptococcus thermophilus. Presentes en menor cantidad: E. faecalis, Lactococcus lactis subsp. lactis, L. lactis subsp. cremoris mesófilos y termófilos y los lactobacilos.

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