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H.I.G.A. EVA PERON Bioq. A. Esteban Burgos Bioq. Lorena P. Del Vecchio.

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Presentación del tema: "H.I.G.A. EVA PERON Bioq. A. Esteban Burgos Bioq. Lorena P. Del Vecchio."— Transcripción de la presentación:

1 H.I.G.A. EVA PERON Bioq. A. Esteban Burgos Bioq. Lorena P. Del Vecchio

2 INTRODUCCION HPV Familia papillomaviridae. virus de ADN doble cadena circular de 8000 pares de bases. viriones de 55 nm de diámetro, desnudos. Genoma E (early) 8 ORF L (late) 2 (L1 y L2) prot de cápside

3 E6 y E7 expresan oncoproteínas L1 y L2 expresan proteínas de la cápside

4 Hay más de 60 tipos de HPV conocidos HPV de bajo riesgo (6, 11,42,43) detectados en condilomas acuminados y CIN 1 (neoplasia intraepitelial cervical) o SIL (lesión escamosa intaepitelial) principalmente. HPV de alto riesgo (16,18) detectados principalmente en CIN 2, CIN 3 y carcinoma invasor. HPV de riesgo intermedio (31,33,35,39,45,51,52,56,etc) encontrados generalmente en lesiones de alto grado pero no son detectados generalmente en carcinoma invasor.

5 Latencia y desarrollo del tumor Favorecen desarrolloInhiben desarrollo Disminución de c de LangerhansCIF (factor de interferencia celular) genes supresores Acción estrogénicaMacrófagos Traslocaciones o deleciones en cromosoma 11 (que expresa genes supresores o antioncogenes) Células de Langerhans Hábito de fumarLinfocitos T (CD8+) Haplotipo (HLA-B7) impide correcta exposición de péptidos a linfa T

6 Mecanismos de oncogénesis

7 Oncogénesis

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9 Técnicas diagnósticas Citología Colposcopía Histología Estudios virológicos

10 Pap Bajo costo Baja sensibilidad (~50%) Controles de calidad difíciles de implementar.

11 Estudios virológicos moleculares Costosos Alta sensibilidad Controles de calidad de fácil implementación

12 Estudios virológicos Existen varias metodologías, entre ellas: Captura de híbridos PCR -ADN NASBA En nuestro caso vamos a explicar en detalle uno de ellos, el NASBA de un diseño en particular que permitió llevar a cabo un estudio de casos en nuestro hospital.

13 NucliSENS® EasyQ® HPV v1 test El test NucliSENS EasyQ VPH v1.0 es una amplificación de ácido nucleico en tiempo real y de análisis de detección múltiple para la evaluación cualitativa de los ARNm de E6/E7 (VPH 16, 18, 31, 33 y 45) detectados en aproximadamente el 82% de todos los carcinomas cervicales y ARNm de U1A usado como control interno.

14 Metodología Aislamiento del target Amplificación Detección Validación e interpretación

15 Aislamiento del ácido nucleico Homogeneizado y centrifugación. Muestras cervicales en tampón de lisis que contiene tiocianato de guanidina y Tritón X-100. Se añade sílice magnética. Los ácidos nucleicos en la mezcla, se unen a las partículas magnéticas de dióxido de sílice en las condiciones de alta salinidad. Se lava varias veces. Los ácidos nucleicos se eluyen de la fase sólida.

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18 La detección de productos de amplificación del ensayo es llevada a cabo en tiempo real. Para detectar la amplificación del ARNm específicos se usan seis beacons diferentes en la EasyQ NucliSENS HPV v1; un beacon específico para cada uno de los subtipos amplicones y el otro para los amplicones U1A. El uso de dos tintes fluorescentes (6-FAM y el ROX-6) permite la detección de los RNAs diana contra el VPH tres reacciones dúplex: U1A y HPV 16 HPV 18 y HPV 31 HPV 33 y HPV 45.

19 Especificidad analítica del ensayo Basada en una cuidadosa selección de primers y de sondas tomando en cuenta de los virus genéticamente relacionado y los otros organismos que se sabe que se encuentran en los exudados cervicovaginales. La reactividad cruzada de diversos microorganismos se evaluó mediante pruebas directamente de los ácidos nucleicos a partir de estos organismos. No se encontró reactividad cruzada con los organismos Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Escherichia coli, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Candida albicans, Gardnerella vaginalis, Human immunodeficiency virus, Enterococcus faecalis, Hepatitis C virus, Ureaplasma urealyticum, Hepatitis B virus, Staphylococcus aureus

20 Importante ! Aumenta significativamente la sensibilidad y la eficacia del screening de los pacientes con cáncer de cuello uterino que antes se basaban exclusivamente en la citología y el pruebas de Papanicolaou. La detección de la expresión del ARNm HPV E6/E7 detecta no sólo la infección por HPV sino también la pesquisa de la actividad oncogénica de los virus. Por lo tanto estos ensayos están destinados a ser utilizados como una herramienta para la identificación de patologías clínicamente relevantes del VPH y/o para la selección y estratificación de riesgo de los pacientes con citología anormal y/o síntomas clínicos.

21 UTILIDAD DE LA DETECCIÓN DE ARNm DE ONCOPROTEINAS E6 E7 DE HPV 16, 18, 31, 33 Y 45 (NucliSENS® EasyQ® HPV v1 test) EN EL MANEJO DE LAS LESIONES INTRAEPITELIALES DE CUELLO UTERINO. ESTUDIO PRELIMINAR Tilli, M. ; Perroni, N.; Sadier, E. ; Gallardo, E. ; Martinez Cuerda, MC y Mormandi, JO HIGA Eva Perón. San Martín. Pcia. de Buenos Aires Objetivo Estimar en que proporción existe expresión de ARNm de oncoproteinas E6 E7 de HPV 16, 18, 31, 33 y 45 en pacientes con antecedentes de lesiones cervicales de bajo o alto grado, o con lesiones actuales.

22 Materiales y Métodos: Se evaluarán en forma prospectiva 71 pacientes derivadas del servicio de ginecología, por presentar antecedentes de lesiones cervicales de bajo o alto grado, o con lesiones actuales. Las pacientes se dividieron en 6 grupos: 1.Citología anormal(ASCUS-SBG) 2. Antecedente de SIL bajo grado 3. Antecedente de SIL alto grado 4. SIL bajo grado actual 5. SIL alto grado actual 6. Sin patología cervical (VIH positivas) Las muestras fueron tomadas con cytobrush de endocervix y se les practicó la nueva ténica de biología molecular: NucliSENS Easy Q HPV v 1.0 (Laboratorio BioMérieux) que es un ensayo de amplificación y detección real time para la determinación cualitativa de mRNA E6/E7 para cinco tipos de HPV carcinogénicos : 16, 18, 31, 33 y 45

23 Resultados

24 Se detectó ARNm en 13 de las 71 muestras analizadas (18.30%). En 6 casos ARNm de HPV 16, en 5 casos de HPV 18, en 1 caso de HPV 31 y un caso de HPV 45. El promedio de edad fue de 27 años (rango: 19 a 35). En pacientes con lesiones de alto grado la prueba fue positiva en 4 de 6 pacientes (66.7%). En lesiones de bajo grado en 3 de 15 pacientes (20%). En citologías anormales (ASCUS o LSIL) se observó positividad en un caso de 7 pacientes estudiadas (14.28%).

25 Conclusiones El empleo de esta nueva técnica de biología molecular (NucliSENS® EasyQ® HPV v1 test) permitió detectar ARNm de oncoproteinas E6 y E7 en 13 de las 71 muestras analizadas (18.30%). Los ARNm de HPV 16 y 18 fueron los mas prevalentes. Los estudios virológicos tienen un rol complementario en el diagnóstico de infección y progresión por HPV, se propone su uso en el screening primario por su alta sensibilidad.

26 Muchas gracias por su atención!!!


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