Interacción Primaria Enzimoinmunoanálisis (EIA) Radioinmunoensayo (RIA) Inmunofluorescencia (IFI, IFD) Comisión 4 – Año 2013

Interacción primaria secundaria Características Interacción simple Ag-Ac NO VISUALIZABLE Formación de complejos macromoleculares VISIBLES MACROSCOPICAMENTE Factores que la condicionan POCA INFLUENCIA DE LAS CONDICIONES DEL MEDIO DEPENDEN DE TEMP Y FZA IONICA (cc de sales) Tipo de Ag y Ac involucrado Ag y Ac monovalentes o polivalentes NO IMP VALENCIA Ac MINIMO bivalente Ag polivalente/particulado VALENCIA > o = 2 Sensibilidad MAYOR MENOR Ka=cte de afinidad y n=representa el nro máximo de moléculas de ligando monovalentes capaces de unirse a una molécula de Ac, o sea el nro de sitios de combinación o valencia de éste.

Interacción primaria Es la unión entre un epítope y un paratope. Ac + Hp AcHp k1 k-1 La interacción entre el epitope y el paratope obedece a la ley de acción de masas. Es una reacción de equilibrio Cuanto más ac agregue a mi muestra mas complejo se formará y más podré detectar Esta interacción está principalmente influenciada por la temperatura A mayor T°, menor tpo preciso La interacción entre el epitope y el paratope obedece a la ley de acción de masas. Es una reacción de equilibrio Por tanto cuanto más ac agregue a mi muestra (p det un ag) mas complejo se formará y más podré detectar. Esta interacción está principalmente influenciada por la temperatura. Asi a mayor T°, menor tpo preciso O SEA! Esta constante está influenciada por las cc de los miembros del equilibrio y por la temperatura.

Parámetros de la Interacción Primaria Afinidad- Avidez Afinidad: es la fuerza de unión o reacción entre un solo sitio de combinación del anticuerpo (paratope) con un solo determinante antigénico (epitope). Es la sumatoria de fuerzas de atracción y repulsión entre ellos. Avidez: es la fuerza total de unión de antígenos multivalentes con anticuerpos multivalentes.

Componentes de los EIA (Enzimoinmunoensayos) Componente Incógnita (puede ser Ac o Ag) Componente que se una al incógnita (puede ser Ac o Ag) Componente que revele dicha interacción (en los EIA se une una Enzima, se le agrega el sustrato y da un producto CROMOGENICO) Se mide el color por Densidad Óptica Interacción Primaria

Se basan en: La elevada especificidad de los Ac La alta actividad de algunas enzimas usadas en este tipo de ensayos, lo que permite la amplificación de la señal generada por la muestra. Dos etapas grales: La rx de un inmunoreactante con un ag o un ac La detección de ese inmunoreactante mediante la utilización de un conjugado enzimático.

EIA (Enzimoinmunoensayo) Se basan en: La elevada especificidad de los Ac La alta actividad de algunas enzimas lo que permite la señal generada por la muestra. Dos etapas grales: La rx de un inmunoreactante con un ag o un ac La detección de ese inmunoreactante mediante la utilización de un conjugado enzimático.

EIA homogéneo 1er Caso Hp Do título 2do Caso Hp Do Cc de Ag.

EIA homogéneo En el 1er caso, el Hp está conjugado con la enzima. El OBJETIVO es determinar el titulo de un Ac específico. La presencia del mismo en la muestra al unirse al Hp, inhibirá la actividad de la enzima. Por tanto, disminuirá la DO cuanto mayor sea el título. Como obtengo el título?

No es necesario separar los complejos Ag-Ac del antígeno libre. EIA homogéneo No es necesario separar los complejos Ag-Ac del antígeno libre. Importante! El Ac debe cambiar la actividad de la enzima. Como el ag marcado y la muestra se incuban juntos, esta última no puede contener isoenzimas, sustratos o inhibidores enzimáticos. Los Hp deben ser de tamaño pequeño, asi la interacción enzima-Ac no son afectadas por el ag. Usos: Ej - cuantificación de T4

EIA homogéneo Variante competitiva Hp Muestra incógnita Hp Hp Hp Do Cc. de Ag Por que no usar la variante anterior para cuantificar hapteno? Porque no tengo Ac específico marcado con enzima.

Competitivo… S Suero problema Do P Ac conjugado Ag sensibilizante título En el 1er caso, el OBJETIVO es determinar el título de un Ac específico. Para esto se sensibiliza una placa y se incuba la muestra incógnita con un Ac específico marcado. Cuanto mayor sea la señal, menos Ac en la muestra.

Competitivo… P S Ag conjugado Do Ag a determinar Ac captura Cc ag En el 2do caso, el OBJETIVO es determinar un ag. Entonces, se sensibiliza la placa con un Ac de captura y compite el ag marcado con enzima y el ag sin marcar de mi muestra incógnita. Cuanto mayor sea la señal, menor cantidad de dicho ag en la muestra.

No competitivo… Indirecto S P Do Ac conjugado Suero problema título Ac conjugado Suero problema Ag sensibilizante Indirecto En el 1er caso, el OBJETIVO es determinarr un Ac específico en una suero problema. Entonces sensibilizamos una placa con ag específico, incubo con la muestra, lavo, agrego el conjugado. .

No competitivo… Sandwich S Do P Ac conjugado Ag a determinar Ac captura Do cc del Ag Ag a determinar Sandwich En el 2do caso, el OBJETIVO es determinar un ag. Asi sensibilizo la placa con un Ac específico, incubo con la muestra, lavo, agrego el conjugado. Mejor si ambos Ac son de la misma especie para evitar reactividad cruzada. Addemás tener en cuenta que sean específicos para distinto epitope, sino no se va a unir el congujado porque va a estar unido al sensibilizante.

Como obtengo la curva?? Con diluciones seriadas de un ag de concentración conocida y los demás componentes del sistema constantes Do Cc ag Do Cc del Ag NO COMPETITIVO COMPETITIVO

Entonces… ELISA no competitivo ELISA competitivo Inmovilización del inmunoreactante (Ag o Ac) a la fase sólida Bloqueo Incubación con el patrón y/o la muestra Incubación con el ag marcado así como con el patrón y/o la muestra Incubación con el Ac de detección Revelado (reacción colorimétrica) ELISA en Sandwich y competitivo son los más ampliamente utilizados Etapas básicas: Sensibilización, Incubación, Revelado. Importante!! Lavar entre pasos.

Puesta a punto de la técnica…

Sensibilización de la placa Materiales más usados (PVC y poliestireno). Que ag? ADN, proteínas y oligopéptidos, células enteras En cambio, la preincubación de la muestra no debe usarse tubos de poliestireno porque se pegan las proteínas!

Bloqueo

Lavados Se eliminan componentes libres o unidos de manera no específica al inmunoreactante inmovilizado en la placa. Se utilizan soluciones salinas isotónicas (misma cc de solutos afuera que adentro de las celulas, ej.PBS) suplementadas con detergente (para impedir interacciones hidrofobicas inespecificas , ej.Tween 20).

Titulación del conjugado Dil conj suero 1/400 1/800 1/1600 1/3200 Positivo fuerte ++++ +++ ++ Positivo débil + +/- negativo - Como el elisa es una técnica de gran sensibilidad. Entonces debo poder diferenciar entre estos 3 grupos para evitar que se escapen los falsos negativos. Cc óptima de conjugado

Revelado Se pueden emplear: Peroxidasa de rábano (Oxidación) 2 DH + H2O2  2H2O + 2D- COLOR!! Donante de H: OPD (490nm) Fosfatasa alcalina (Desforforilacion) sustrato: p-nitro fenil fosfato  p-nitro fenol (405nm) COLOR!! OPD= orto-difenildiamina Se emplean donantes de H. Entonces el DH se oxida a D y se obtiene un producto coloreado.

Controles Control Positivo Control Negativo Control de inespecífico: Suero especifico Suero no inmune Control de inespecífico: Blanco: + OPD

Aplicaciones Cualitativas: Semicuantitativas: Cuantitativas: Determinar la presencia de Ac específicos Determinar la presencia de ag en una muestra Semicuantitativas: Titulación de Ac específicos Cuantitativas: Determinar la cc de un antígeno en una muestra

Procesamiento de datos y expresión de resultados en ensayos inmunoenzimáticos

La capacidad de no producir falsos negativos. ESPECIFICIDAD SENSIBILIDAD Es la medida de la habilidad del ensayo de mostrar como positiva a una muestra que realmente lo es aun cuando esta presente bajas cantidades del componente incógnita. La capacidad de no producir falsos negativos. ESPECIFICIDAD Es la medida de la habilidad del ensayo de mostrar como negativa a una muestra que realmente es negativa. La capacidad de no producir falsos positivos.

Cálculo del valor de corte (cut off) Se construyen curvas para un gran número de sueros negativos y se grafica frecuencia (f) vs DO. Se calcula la media y el DS: f DO x Mtras (-) (+) 2SD 3SD Cut off X+3DS si la DO es menor a este valor el suero es negativo con un 99 % de certeza (van a haber falsos negativos)  alta especificidad X+2DS cut off si la DO es menor a este valor el suero es negativo con un 95 % de certeza (van a haber falsos positivos) alta sensibilidad

Ensayo cualitativo (detección de Ac) Se pone una única dilución del suero y se mide la absorbancia, se informa como positivo si cae por encima del cut off. Ejemplo: Abs 1: 0,208 Abs 2: 1,034 Cut off: 1,090 Abs 3: 2,023

Ensayo semicuantitativo Se hacen diluciones seriadas del suero a valorar y se grafica DO vs dil suero. El título es la inversa de la última dilución que desarrolla una DO mayor al cut off Frec DO Mtras (-) Mtras (+) Cut off DO x Titulo Dil suero

Ensayo cuantitativo Se determina la cc de ag por comparación con una curva patrón. cc antígeno patrón cc muestra DO DO incógnita