CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS VELAZQUEZ ORTIZ INDRA V.

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1 CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS VELAZQUEZ ORTIZ INDRA V.

2 ¿CON QUÉ MÉTODOS PUEDO CUANTIFICAR PROTEÍNA?
Los métodos principales son: UV 280 Biuret Lowry Bradford

3 LEY DE LAMBERT-BEER la ley explica que hay una relación exponencial entre la transmisión de luz a través de una sustancia y la concentración de la sustancia, así como también entre la transmisión y la longitud del cuerpo que la luz atraviesa. Si conocemos Io y Is, la concentración de la sustancia puede ser deducida a partir de la cantidad de luz transmitida. Considérese un rayo de energía radiante con una intensidad inicial Io que se hace pasar a través de una celda de vidrio cuadrada contiendo una solución homogénea de una sustancia que absorbe luz de cierta longitud de onda. La intensidad de la energía radiante transmitida Is es menor a la intensidad inicial Io. debido precisamente a que la solución fue capaz de absorber cierta cantidad de energía radiante.

4 METODO UV LAS PROTEÍNAS MUESTRAN UN FUERTE GRADO DE ABSORCIÓN A 280nm EN UV, PRINCIPALMENTE POR LOS RESIDUOS DE TRIPTOFANO Y LA TIROSINA. YA QUE LAS CONCENTRACIONES DE ESTOS AMINOÁCIDOS EN LAS PROTEÍNAS ES FRANCAMENTE CONSTANTE SE PUEDE UTILIZAR LA ABSORBANCIA A 280nm PARA ESTIMAR LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS

5 VENTAJAS MÉTODO RÁPIDO Y RELATIVAMENTE SENSIBLE (VARIAS VECES MÁS SENSIBLE QUE EL MÉTODO DE BIURET) NO EXISTE INTERFERENCIA DEL SULFATO DE AMONIO Y OTRAS SALES BUFFER MÉTODO NO DESTRUCTIVO UTILIZADO EN DETECCIÓN POST-COLUMNA DE LAS PROTEÍNAS

6 DESVENTAJAS LOS ÁCIDOS NUCLÉICOS TAMBIÉN ABSORBEN EN LA REGIÓN DE 280nm EL CONTENIDO DE AMINOÁCIDOS AROMÁTICOS DIFIERE CONSIDERABLEMENTE EN VARIAS PROTEÍNAS. LA SOLUCIÓN DEBE SER CLARA E INCOLORA. LA TURBIDEZ PUEDE PRODUCIR RESULTADOS ERRÁTICOS SE REQUIERE UN SISTEMA RELATIVAMENTE PURO PARA UTILIZAR ESTE MÉTODO

7 MÉTODO DE BIURET El reactivo de Biuret se compone de hidróxido de sodio y sulfato de cobre (solución alcalina fuerte), el grupo amino de las proteínas reacciona con los iones del cobre del reactivo dando el color púrpura, la cantidad del color producido es proporcional al número de enlaces peptídicos, y por lo tanto a la cantidad de proteína.

8 METODO 5 mL DE REACTIVO DE BIURET SE MEZCLA CON 1mL DE SOLUCIÓN PROTÉICA (1-10 mg DE PROTEÍNA/mL). DESPUÉS DE REPOSO A TEMPERATURA AMBIENTE DURANTE 15 A 30 MINUTOS, SE LEE LA ABSORBANCIA A 540nm CONTRA UN BLANCO CON SÓLO REACTIVO. SE DEBE ELABORAR UNA CURVA ESTÁNDAR DE CONCENTRACIÓN VS ABSORBANCIA UTILIZANDO ALBÚMINA DE SUERO DE BOVINO (BSA) PARA COMPARACIÓN CON LA MUESTRA BAJO ESTUDIO

9 VENTAJAS: RÁPIDO (SE PUEDE COMPLETAR EN MENOS DE 30 MINUTOS) ES EL MÉTODO MÁS SIMPLE DE ANÁLISIS DE PROTEÍNAS NO ES FRECUENTE ENCONTRAR DERIVACIONES DE COLOR POCAS SUBSTANCIAS NO PROTÉICAS INTERFIEREN CON LA REACCIÓN DE BIURET NO DETECTA N2 DE FUENTES NO PROTÉICAS O NO PEPTÍDICAS

10 DESVENTAJAS: NO ES MUY SENSIBLE COMPARADO CON EL MÉTODO DE LOWRY REQUIERE DE AL MENOS 2 A 4 mg DE PROTEÍNA POR PRUEBA LAS CONCENTRACIONES ALTAS DE SALES DE AMONIO INTERFIEREN CON LA REACCIÓN DEBE ESTANDARIZARSE EL COLOR MEDIANTE CANTIDADES DE PROTEÍNA CONOCIDAS

11 MÉTODO DE LOWRY El método de Lowry es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. A la muestra se le añade un reactivo que forma un complejo coloreado con las proteínas, siendo la intensidad de color proporcional a la concentración de proteínas, según la ley de Lambert-Beer.

12 1) Los iones Cu2+, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+ proteína tienen un color azul claro. Además, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose los residuos fenólicos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reacción. 2) Se lleva acabo la reducción del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina presentes en la mayoría de las proteínas, actuando el cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenólicos da lugar a un complejo de color azul intenso.

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14 VENTAJAS MUY SENSIBLE MENOS AFECTADO POR LA TURBIDEZ DE LA MUESTRA MÁS ESPECÍFICO QUE LA MAYORÍA DE LOS OTROS MÉTODOS RELATIVAMENTE SIMPLE SE PUEDE COMPLETAR EN 1 A 1.5 HORAS

15 DESVENTAJAS EL COLOR VARÍA CON DIFERENTES PROTEÍNAS (MÁS QUE EL MÉTODO DE BIURET) EL COLOR NO ES ESTRICTAMENTE PROPORCIONAL A LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS LA SACAROSA, LÍPIDOS, BUFFERS FOSFATO, MONOSACÁRIDOS Y HEXOAMINAS INTERFIEREN CON LA REACCIÓN LAS ALTAS CONCENTRACIONES DE AZÚCARES REDUCTORES, SULFATO DE AMONIO Y COMPUESTOS CON SULFIDRILO INTERFIEREN CON LA REACCION.

16 MÉTODO DE BRADFORD EL AZÚL BRILLANTE G-250 COOMASSIE SE ADHIERE A LA PROTEÍNA, EL COLORANTE SE TORNA DE ROJIZO A AZULADO YE L MÁXIMO DE ABSORCIÓN DEL COLORANTE CAMBIA DE 465 A 595nm. EL CAMBIO EN LA ABSORBANCIA A 595nm ES PROPORCIONAL A LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNA EN LA MUESTRA.

17 VENTAJAS MÉTODO RÁPIDO (LA REACCIÓN SE PUEDE COMPLETAR EN 2 MINUTOS) REPRODUCIBLE SENSIBLE (MUCHO MÁS QUE EL MÉTODO DE LOWRY) NO EXISTE INTERFERENCIA DE CATIONES COMO K+, Na+, Y Mg+

18 DESVENTAJAS EL COMPLEJO PROTEÍNA-COLORANTE FORMADO PUEDE UNIRSE A LAS CELDAS DE CUARZO EL COLOR VARÍA CON DIFERENTES TIPOS DE PROTEÍNAS. LA PROTEÍNA ESTÁNDAR DEBE SELECCIONARSE CON MUCHO CUIDADO INTERFERENCIA CON DETERGENTES.