Nuevas Tendencias en Análisis Microbiológico de Cosméticos Q.F. Rosina Odino Uruguay

Introducción Definición Cosmético: «Dicho de un producto: Que se utiliza para la higiene o belleza del cuerpo, especialmente del rostro.» (RAE 22da Edición) Qué quiere decir esto que el espectro de productos que estamos manejando es amplísimo. Desde jabones, desodorantes, cremas dentales a maquillaje, protectores solares, etc.

Análisis Microbiológico: 1) Recuento en placa (bacterias, hongos y levaduras) 2) Búsqueda de microorganismos específicos 3) Challenge Test o Preservative Efficacy Test 2) A bacterium, yeast, or mold that may cause disease, product spoilage, and/or indicate poor plant housekeeping. 3) It will tell you how well your preservative works in your specific formula. For this test, 5 or more known microbes (both bacteria and fungus) are individually added to the cosmetic sample. Plate counts are done at various time points over 28 days or more. The counts in the product should decrease 90% or more over a 14 day period and not increase again after that. A less effective version of this test can be called the “common usage test”. For this you would first have your product tested to assure it is without significant contamination initially, then use and abuse a sample for 2-3 weeks (sticking fingers into it) knowing that you are introducing bacteria and fungus into it. Then have it tested again to see how your product holds up to that insult. The counts for the second testing should be as low as the first testing. These tests will give information on how well the preservative you use is working in your system.

Desestabilización de emulsiones Etc ¿Por qué controlar la presencia de microorganismos presentes en estos productos? Olor Color Desestabilización de emulsiones Etc Pero más importante, puede tener efectos en la salud del consumidor: Comezón en la piel Infecciones Ceguera Pseudomonas aeruginosa: queratitis (inflamación de la cornea) si está en máscaras, delineadores, etc. Burkholderia cepacia: variedad de problemas, ej pneumonia, en personas inmunodeprimidas (se encuentra en productos acuosos, shampoos, acondicionadores, lociones corporales)

Método Tradicional Método de Recuento en Placa - Cuantitativo Se cuenta el número de bacterias aeróbicas y hongos y levaduras, utilizando técnicas de dilución y siembra en placa Técnicas de Enriquecimiento - Cualitativas Enriquecimiento en caldo seguido de medio no selectivo. Niveles bajos y/o células estresadas

¿ Por qué surgen alternativas?

Métodos Tradicionales Tiempo (mínimo 4 d) Días de producto sin poder venderse Qué implica esto? $$$ y no poder responder rápido a las necesidades del mercado

Métodos Alternativos Reducción del tiempo También: - Fáciles de usar - Precisos - Económicamente rentables – menor gasto de material y equilibrio costo-beneficio

Métodos Alternativos Principales requisitos: • Exactitud en la obtención de resultados (considerando: sensibilidad, limites de detección mínimos, especificidad del sistema de análisis, comparación con métodos de referencia). • Rapidez: tiempo mínimo requerido para la obtención de resultados. • Costo mínimo: inicial, por análisis, reactivos, mano de obra. • Aceptabilidad: por parte de la comunidad científica y de las agencias reguladoras.

Métodos Alternativos Principales requisitos: • Sencillez de manejo: preparación de la muestra, funcionamiento del equipo analítico y procesamiento informático de los datos • Calificación y formación del personal adecuada para la técnica a realizar. • Reactivos: facilidad de preparación, estabilidad, disponibilidad. • Soporte técnico adecuado: rapidez, disponibilidad y coste. • Mínimo espacio util requerido.

Métodos Alternativos

Métodos Alternativos IMPORTANTE Etapa previa de enriquecimiento Confirmación de resultados positivos En la mayoría de los casos, el empleo de métodos rápidos de analisis microbiologico requiere… Vamos a ver que hay excepciones. Al primer punto, por ejemplo, los equipos que miden en tiempo real. Test Negativo = Pasa Test Positivo = Confirmación

Métodos Alternativos Al igual que en el caso de los métodos tradicionales, es vital una adecuada toma y preparación de las MUESTRAS a analizar • Para muestras solidas se han desarrollado instrumentos gravimétricos que realizan automáticamente las diluciones programadas de las muestras. Ej: Dilumat, AES Chemunex; Dilumacher, PBI; Labpro Gravimetric Diluter, Spiral Biotech. También se han diseñado homogeneizadores que funcionan mediante ondas de choque y una intensa agitaciÓn que permite una mejor transferencia de los microorganismos del producto al diluyente, produciendo una mínima destrucción de la muestra. Ej: Pulsifier de Microgen. • Para muestras líquidas se han desarrollado equipos que permiten realizar de forma automatizada diluciones seriadas de una muestra problema. Ej: sistema Rapid Plate 96 Pipettting Workstation de Zymark Corpo.; Dilucup, LabRobots Products AB. Estos no son métodos alternativos propiamente dichos sino avances tecnológicos para estas etapas.

1) Siembra en espiral Recuento Total de Microorganismos Aerobios o Recuento de Células Viables o Recuento en Placa, etc. Este espiral de “Arquimedes” produce un gradiente de concentracion que va decreciendo desde el centro hasta la periferia de la placa a medida que rota sobre si misma. El volumen de muestra que se deposita en cada zona de la placa es conocido y el tiempo requerido en realizar esta operación es de segundos. Por lo general va asociado a un lector electrónico de colonias. Se cuenta en un área determinada el número de colonias y se hacen los cálculos para obtener el recuento por gramo o mililitro de la muestra. Alternativamente, se puede utilizar para el recuento un sistema automático.

Obstrucción de la aguja Placas uniformes, sin burbujas ni humedad Ventajas Costos bajos Sencillez Ahorro de tiempo Automatización Desventajas Obstrucción de la aguja Placas uniformes, sin burbujas ni humedad Ventaja: muchas veces CIP y SIP. Para la obstrucción se filtra la muestra.

2) Sistema Iso-Grid

Ventajas Exactitud Desventajas Preparación de placas Esterilización de equipo de filtración

3) Petrifilm

Ventajas No requiere preparación previa de medios de cultivo (reduce costos y tiempo de preparación) Poco espacio Desventajas - Pérdida de muestra líquida al esparcir

4) Bioluminiscencia o medida del ATP Todas las celulas vivas contienen ATP, que se degrada muy rapidamente mediante autolisis al morir las celulas. En presencia de la enzima luciferasa y el sustrato luciferina (procedentes de la luciernaga), oxigeno y magnesio, el ATP facilita el paso de la luciferina a oxiluciferina, generandose luz (bioluminiscencia) que puede ser detectada mediante un luminometro (13). La cantidad de luz emitida en esta reaccion es directamente proporcional a la cantidad de ATP presente en la muestra, es decir, al numero de celulas vivas, y puede ser utilizada para estimar la biomasa celular de una muestra.

- Interferencias con ATP residual Ventajas Reducción del tiempo Desventajas - Interferencias con ATP residual 24-48 h

5) Impedimetría Tiempo de Detección Umbral = Tiempo entre inicio de la medición hasta cambio en el parámetro eléctrico seleccionado Tiempo de detección debe ser calibrado frente a una población de microorganismos determinada mediante métodos convencionales para que la electrometría permita estimar el recuento de microorganismos presentes La impedancia es la resistencia al paso de una corriente alterna a traves de un material conductor, como puede ser un medio de cultivo. Cuando los microorganismos crecen, metabolizan sustratos no ionicos de baja conductividad (proteinas, carbohidratos y grasas) convirtiendolos en metabolitos ionicos de una conductividad mayor (acidos grasos, aminoacidos y acidos organicos). Por tanto, la degradacion metabolica de sustratos o nutrientes por los microorganismos durante su crecimiento en un medio de cultivo produce cambios en la resistencia electrica del mismo. Mediante su monitorizacion o registro automatizado es posible estimar la actividad metabolica de celulas viables de una forma mas rapida que con las tecnicas tradicionales. Refleja las variaciones iónicas del medio de cultivo producto de la actividad metabólica de los microorganismos.

Tiempo (6-24 h RTMA, 24–48 h RTCHL) Ventajas Tiempo (6-24 h RTMA, 24–48 h RTCHL) Puede emplearse en medios ópticamente opacos Desventajas «Calibración» sin necesidad de diluciones que enlentecen los tiempos de detección. Esto es fundamental vs la Turbidimetría (aunque esta no se utiliza por lo gral en cosméticos por su baja sensibilidad, no es capaz de detectar niveles de concentracion inferiores a 105 ufc/mL). «Calibración» porque no es una desventaja en si, sino una peculiaridad del método.

6) Citometría de flujo Es el primero que vemos que cuenta en tiempo real.

Cuantitativa y Cualitativa Sensibilidad Ventajas Rapidez Cuantitativa y Cualitativa Sensibilidad Desventajas - Equipos costosos No es necesario enriquecimientos ni cultivo de muestras

Ejemplo de implementación de un Método Alternativo No es necesario enriquecimientos ni cultivo de muestras

¿Preguntas?

Referencias Métodos rápidos y automatizados aplicados al análisis microbiológico de los alimentos – Rosario Martin De Santos. Food Microbiology and Analytical Methods: New Technologies - Mary Lou Tortorello, Steven M. Gendel. Comparison of Redigel, Petrifilm, Spiral Plate System, Isogrid and Standard Plate Count for the Aerobic Plate Count on Selected Food – Vicky S. Chain

Muchas gracias rosinaodino@yahoo.com