High Performance Liquid Chromatography (HPLC) María del Pilar Sierra Gómez

Cromatografía liquida de alta resolución (HPLC) Es una técnica analítica para la separación y determinación de compuestos Orgánicos Inorgánicos Desarrollada a mediados de los setenta La Cromatografia es un metodo físico de separación en el cual los componentes son separados por medio de dos fases: Estacionaria (Columna) Fase movil (Solvente liquido)

Trabaja con altas presiones Usa columnas empacadas con fase estacionaria (ej.silica). La separación eficiente de los compuestos de interes en una muestra dependen de la elección del tipo de columna y la fase movil. (Skoog, 1996) En una cromatografia de columna el numero de compuestos pueden ser separados en picos individuales en una sola corrida.

Importancia Permite el análisis cuantitativo y cualitativo de una gran variedad de compuestos. Acidos Organicos Polifenoles Azucares

Componentes Mobile Phase Reservoirs and Solvent Treating Systems Sample Injection System Pumping System Detector Degasser Integrator Column

El equipo se compone Solventes Degasificador Bomba Puerto de Inyección Columna Detector Analizador de datos (Integrador)

Disolventes Utiliza agua y soluciones amortiguadoras, disolventes de baja viscosidad. La elección del disolvente depende de la afinidad con la columna y el compuesto Debe evitarse solventes de alta viscosidad Debe estar pura (libre de partículas e impurezas) Disolventes utilizados deben ser grado HPLC Deben ser desgasificados

Bomba Alta presión Obtenga reproducibilidad, velocidad de flujo estable Capaz de hacer gradiente de elusión (uso de varios disolventes) Capaz de hacer elusión isocrática (Un solo disolvente)

Inyector Consiste de un aro de acero inoxidable. Conduce la muestra por capilares hacia el sistema, hasta la columna sin interrumpir el flujo de los disolventes.

Columna Normalmente es de 10 a 30 cm y 3 a 10 mm de diámetro usualmente de acero inoxidable. Empacada usualmente hecha silice o alumina Partículas redondas Porosas Peliculares Microporosa

Detector Convierte los cambios en concentración del eluyente de la columna en señales electricas. Depende del tipo de soluto, la concentración y sensitividad Existen cuatro tipos: UV – VIS Fluorescencia Índice de Refracción Análisis electrolítico

Detector UV/VIS Mide absorción de compuestos que tienen cromóforo. Sensitividad y respuesta difiere para analitos según el cromóforo que contenga. Uso: detección de ácidos, vitaminas y amino acidos. Puede ser de largo de onda fijo, variable y arreglo de diodo.

Detector de fluorecencia Mide la emisión de luz Es selectivo y bien sensitivo Ideal para la detección de trazas Usos: Monitoreo aflatoxinas Detección de hidrocarburos Suplementos vitamínicos

Índice de refracción Mide cambios en el índice de refracción de la fase móvil. Sensitivo a temperatura del ambiente Usos Carbohidratos Lípidos

Analizador de datos Detector provee una señal eléctrica Presenta los datos como picos y permite su cuantificación. Reconoce el comienzo, máximo y final del pico. Otorga los valores del tiempo de retención (tiempo en el que aparece el analito de interes) y el área del mismo.

Para determina el contenido del compuesto de interés debe prepararse una curva de calibración la cual se prepara a partir del analito estándar con una pureza >99% y grado HPLC. Con base en esa curva de calibración se determina la ecuación de la recta (Y=mx+b) y se determina la concentración en ppm.

Cromatograma Cromatograma muestra de pulpa de quenepa (Sierra, 2006) Acido cítrico Fase móvil Ac. málico Ac. acético Cromatograma muestra de pulpa de quenepa (Sierra, 2006)

Factores a considerar en un análisis (HPLC) Purificación y extracción de la muestra y/o analito de interés Columna Fase móvil Flujo Temperatura Detector

MOBILE PHASE (H3PO4) 0.1 %

Tratamiento de la muestra Activación Cartrigde Separación y obtención del analito de interes

Inyección de la muestra