Q-PCR y Expresión de Genes Jenny Acevedo

PCR en Tiempo Real Se diferencia de la PCR convencional en que permite monitorizar en cada ciclo la aparición del ADN producto de la reacción mediante el uso de fluoróforos. Cada vez que se realiza una copia del ADN molde se libera fluorescencia, por lo que ésta es proporcional a la cantidad de ADN generado.

Objetivos Estudiantes se familiaricen con la Técnica del qPCR Estudiantes participaran en una investigacion biológica. Analizaran datos de qPCR y haran conclusiones Participaran en investigacion cientifica en forma independiente y en colaboración. Desarrollo del pensamiento crítico y solución de problemas en la investigación biológica. Experimentar los exitos y fracasos del lab en investigación dirigida.

Metas Entender los conceptos del qPCR y el procedimiento experimental. Analizar los resultados obtenidos para cada gen amplificado.

Apis mellifera La abeja de miel Apis mellifera es un insecto social y representa un modelo clave para estudios de comportamiento. Primer insecto Hymenoptera que tiene su genoma completo secuenciado. (The Honey Bee Genome Sequencing Consortium, 2006).

Expresión Génica El nivel de expresión de los genes está relacionado con las niveles de proteínas. Cuando un organismo requiere determinadas proteínas (una sobre-producción temporal de adrenalina por ejemplo), los genes que intervienen en su síntesis alteran su expresión, pudiendo incrementarla (sobre-expresarse) o reducirla (inhibirse). Estos cambios de expresión también se observan en dependencia del tipo de tejido en que actúan, del tiempo transcurrido, del estado del tejido, etc.

Q-RT-PCR Cuantificacion de la Amplificación en Tiempo Real Analisis de la cinetica de la reacción, lo que permite: Detección del producto en cada ciclo de la reacción.

Diseño Experimental Determinar cambios en la expresión genética en cerebros de abejas relacionados con cambios en el comportamiento de defensa (agresividad). Grupo Experimental 1: Variación en niveles de Expresión Genetica entre abejas inducidas o tratadas vs abejas naive (sin ningún tipo de manipulación). Expresión genética transitoria: inducida por la manipulación experimental:

Diseño Experimental Determinar si, los diferentes niveles de sensibilidad de las abejas (Apis mellifera) expuestas al tratamiento estan correlacionadas con diferentes niveles de expresión. Grupo Experimental 2 Variación en niveles de Expresion Genetica: Abejas que se les indujo comportamiento agresivo, mediante aplicación de diferentes voltajes de corriente eléctrica (rangos de variación: 12, 8, 8, 6, 4 volt). Abejas sensitivas-respuesta temprana Abejas resistentes –respuesta tardia Abejas sensibilidad media- respuesta intermedia Buscar correlación de expresión genética de acuerdo al rango de respuesta (sensibilidad)

Materiales y Metodos RNA total, obtenido del cerebro de abejas 5 abejas (tratamiento) 3 abejas (control-Naive) Conversion del RNA a cDNA. Diseño de Primers de genes candidatos: Gene RPS5- HKG- 5HT-Seratonina, Melatonina TpH, Dopamina, Octopamina ND-20Like, ND-51 PCR plates SYBR Green –Master Mix, agua ultrapura.

Genes de Referencia o Housekeeping gen Los genes de referencia pueden mostrar similares niveles de RNA mensajero en diferentes estados del desarrollo de un organismo y no variar en abundancia en respuesta a factores ambientales o tratamientos experimentales. Se usan porque suelen permanecer constantes. RPS5-HKG

Amplificación PCR a tiempo real se visualizan en un gráfico de amplificación. Expresa la fluorescencia leída por el equipo en el eje de las ordenadas y el número de ciclos de la PCR en el eje de las abscisas. Mientras mayor cantidad del ADN blanco haya en una muestra, menor el numero de ciclos (Ct) que se requiere para alcanzar este umbral.

Muestra ΔRn Threshold Control Negativo Basal Ct Número de ciclos

Ct o CP (threshold cycle) Línea base (baseline) Nivel basal de la fluorescencia emitida Definido durante los primeros ciclos de la PCR Programada en cada software de PCR en tiempo real Umbral (threshold) Es el punto de corte de la fluorescencia por encima de la línea base A partir de esta línea de corte se calcula los valores de Ct Ct o CP (threshold cycle) Refleja el punto en el cual un numero suficiente de amplicones se ha acumulado dentro de la reacción y se presenta un crecimiento exponencial

Eficiencia Los productos mas pequeños se amplifican con mayor eficiencia que los productos grandes Factores que lo limitan: cantidad de primer disponible, la actividad de la enzima

CALCULOS Los valores de Ct tanto del HKG como del gen de interes son normalizadas. Se obtiene un ∆Ct tanto del HKG como del gen de interes. Metodo conocido como 2-∆∆Ct Donde: ∆∆Ct = ∆Ct,sample - ∆Ct,reference Fold change (cambio en incremento) = Efficiency-∆∆Ct or 2-∆∆Ct (obteniendose la expresión relativa del gen)

Cuantificación Relativa Analiza los cambios relativos en la cantidad de transcritos se elige como patrón un transcrito de referencia que no varíe su expresión en los tratamientos a analizar, normalmente un gen de mantenimiento (housekeeping). Comparando los Ct del gen de referencia con el gen de interés en muestras tratadas y sin tratar, se pueden determinar cambios relativos en la expresión del gen de interés.

Análisis de la curva de la temperatura de fusión Identifica productos específicos de qPCR mediante el análisis de las curvas de la temperatura de fusión (melting curve). Para discriminar los productos específicos de la PCR es necesario saber que estos se disocian a una temperatura más alta que los artefactos como Dímeros de cebadores (primer dimers).

Curva de disociación

Melt Curve Analysis Example: Presence of Primer Dimers

Curva de denaturación

Factores limitantes de la Eficiencia

Problemas

Importancia Los cambios en los niveles de expresión de los genes pueden tener profundos efectos en las funciones biológicas en las que participan, pudiendo llegar a ser los principales causantes de alteraciones fisiológicas y procesos patológicos. Algunos genes se sobre-expresan (sus niveles son mayores de lo normal) y otros se inhiben (niveles menores que lo normal, pero la mayor parteparte de los genes no cambian su expresion