Facultad de Ciencias Médicas Universidad Nacional de Córdoba MÓDULO OPTATIVO Testosterone reduces macrophage expression of Toll- like receptor 4 in the mouse, a trigger for inflammation and innate immunity Dra. Cristina MALDONADO Centro de Microscopía Electrónica Facultad de Ciencias Médicas Universidad Nacional de Córdoba

 El Sexo es un factor que contribuye a la incidencia y progresión de desórdenes que se asocien con una desregulación del sistema inmune.  Más recientemente se ha informado que también tendría importancia en la susceptibilidad a enfermedades infecciosas.

Evidencias del dimorfismo sexual en la respuesta inmune 1- Las mujeres producen una vigorosa inmunidad humoral y celular. 2- Son más resistentes a las infecciones bacterianas. 3- En mujeres se observa mayor prevalencia de enfermedades autoinmunes como la artritis reumatoideas, lupus, tiroiditis de Hashimoto, la enfermedad de Graves, esclerosis múltiple. 4- Su expresión se exacerban en el embarazo y/o ciclo menstrual. 5- A nivel experimental se concluyó que cambios en los niveles de las hormonas esteroideas pueden modular dichas enfermedades

Las enfermedades autoinmunes son más frecuentes en el sexo femenino Tabla 1: prevalencia de enfermedades autoinmunes según el sexo Enfermedad mujeres:hombres Artritis Reumatoidea 2:1 Lupus eritematoso sistémico 9:1 Cirrosis biliar primaria 9:1 Enfermedad de Grave´s 5:1 Tiroiditis de Hashimoto 40:1 Tomado de :Olsen and Kovacs, Endocrine Reviews 1996; 17:369-84

Hay efidencias de un Dimorfismo sexual en la sensibilidad a infecciones: 1- La testosterona, administrada en forma exógena, incrementa la susceptibilidad de la hembra a la infección con Micobacterium marinum , mientras que la castración atenúa la sensibilidad de los machos 2- Testosterona reduce efectos inducidos por LPS la activación de la transcripción de citoquinas proinflama- torias y la respuesta inmune de macrófagos aislados.

El objetivo de este trabajo fue determinar de qué manera la Testosterona altera la respuesta inmune de los macrófagos.

TRATAMIENTOS IN VITRO Macrófagos: línea celular RAW 264.7 proveniente de ratón, derivadas de células CRL-2278 (ATCC, USA). Fueron crecidas en medio RPMI 1640 conteniendo suero al 2%. A fin de minimizar la exposición a hormonas reproductivas. Para evaluar el efecto de la Testosterona en la expresión de TLR4 se realizó: Tratamiento: propionato de testosterona 1-1000 nM Para evaluar el efecto de la Testosterona en la expresión de TLR4 se realizó: Tratamientos con LPS (1mg/ml) en presencia o ausencia de testosterona 1 M

TRATAMIENTOS IN VIVO I- Castración y reposición de la testosterona: Animales: ratas machos C57BL/6 (Jackson Laboratory, USA), de 8 semanas de edad. I- Castración y reposición de la testosterona: 1º Grupo: Bajo anestesia (Isoflurane inhalada) se procedió a realizar una incisión escrotal bilateral y se removieron los testículos. 2º Grupo: fueron “sham” operados. Ambos grupos se los dejó recuperar por 5 semanas. 3º Grupo: una vez castrados, los animales recibieron inyecciones Subcutáneas de propionato de testosterona en aceite de girasol (5mg/Kg) cada tres días por cinco semanas. Efecto del nivel de Testosterona en la expresión de TLR4

TRATAMIENTOS IN VIVO II- Tratamiento con endotoxina Los tres grupos anteriormente descripto, recibieron inyecciones intraperitoneales (ip) de LPS (5 mg/Kg) aislada de E. coli. Evaluación del estado de los animales a las 24 horas de tratamiento:

METODOLOGÍAS (tratamientos in vivo) 1- Aislamiento de macrófagos peritoneales 1º- cada animal recibió una inyección intraperitoneal de 200 ul de Adyuvante de Freunds incompleto. 2º- Tres días después, la cavidad peritoneal se lavó con medio RPMI 1640 (7 x 1.5 ml por animal) conteniendo 10% de Suero Fetal Bovino a fin de remover los macrófagos. 3º- Las células se lavaron con RPMI 1640, y los macrófagos adherentes se cultivan en el mismo medio conteniendo 2% de Suero Fetal Bovino y Gentamicina.

METODOLOGÍAS 2- Inmunofluorescencia para TLR4/MD-2 Anticuerpo: anti TLR4/MD2 (eBioscience): se determinó la presencia de TLR4 asociado con MD-2, la molécula permisiva. Revelado:marcado con phy6coerythrin (PE-conjugated antibody, 45 minutos a 4ºC, FACS.

METODOLOGÍAS 3- Cuantificación de TNF e Interleukina 6 ELISA para IL6: se usó un anticuerpo de captura anti IL6 (PharMingen) y un anticuerpo biotinado anti-IL6 de ratón. El revelado final con streptavidina-HRP (BD PharMingen). El menor nivel de detección fue de 4 pg/ml. ELISA para TNF: kit comercial (R&D System). El menor nivel de detección es 16 pg/ml

RESULTADOS IN VITRO

RESULTADOS 1- La testosterona disminuye la expresión de TLR4 en células RAW 264,7 24 hr – Testosterone 1M Figure 1: CITOMETRÍA DE FLUJO

¿ Testosterona disminuye la sensibilidad de los macrófagos a LPS, ligando específico de TLR4?

Sin Testosterona Testosterona 1 uM 703 ± 15 pg/ml 620 ± 20 pg/ml 2- Testosterona disminuye los niveles de TNF inducidos in vitro por LPS Pretratamiento in vitro con Testosterona Sin Testosterona Testosterona 1 uM 703 ± 15 pg/ml 620 ± 20 pg/ml Técnica de ELISA . P < 0,05

RESULTADOS IN VITRO

3- Testosterona disminuye la expresión de TLR4 en superficie, en macrófagos aislados de animales desprovistos de andrógenos endógenos

4- Testosterona disminuye la expresión de TNF inducida por LPS (250 ng/ml por 12 horas) en los macrófagos aislados de animales desprovistos de andrógenos endógenos .

5- Testosterona endógena disminuye la expresión superficial de TLR4 en monocitos in vivo.

6- En los animales castrados, la supresión de testosterona endógena eleva la susceptibilidad al shock endotóxico in vivo.

PRINCIPALES CONCLUSIONES Testosterona induce disminución significativa de la expresión superficial de TLR4 en macrófagos cultivados en ausencia de andrógenos o provenientes de animales castrados. Testosterona disminuye la sensibilidad para responder a LPS, ligando específico de TLR4. - El déficit de testosterona determina mayor susceptibilidad al shock endotóxico - Estos efectos serían parte de los efectos inmunosupresivos de la testosterona

IMPLICANCIAS Y RELACIONES CON ANTECEDENTES Estos resultados permiten explicar el efecto de testosterona disminuyendo la producción de respuesta inflamatoria inducida por LPS. También permiten explicar la mayor incidencia y severidad de la sepsis Bacteriana observada en machos que los vuelve más sensibles al shock séptico que las hembras

MUCHAS GRACIAS