Pruebas microbiológicas rápidas de los alimentos Dra. Keiko Shirai

Métodos Tradicionales (cuenta en placa, NMP) –simple –económico –aceptado Métodos Rápidos –rápidos –sensibles

Técnicas de cultivo Los m.o. generalmente se encuentran como poblaciones mixtas y deben ser aisladas como cultivos puros. Un cultivo puro consiste de una población de células que provienen de una sola célula –Técnica de estría en placa –Transferencia aséptica de un cultivo Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa

Técnica de estría en placa Un cultivo mixto es depositado en un área de una caja petri con agar, con un asa de siembra estéril se estría el agar varias veces. El asa de siembra puede ser esterilizada antes de estriar nuevamente el agar. Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa

Cuando la técnica de estría en placa ha sido llevada acabo adecuadamente, las células bacterianas se multiplicarán y crecerán en distintas poblaciones o colonias. Las colonias formadas por diferentes bacterias tienen diversas formas, tamaño y pigmentación. Esas diferencias pueden ayudar en la obtención de cultivos puros Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa

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Transferencia aséptica de un cultivo Este término es utilizado para describir el procedimiento de transferencia de m.o. de un medio de cultivo a otro, de tal forma que se elimine la contaminación por m.o. indeseables. Es importante trabajar rápido y mantener los tubos en un ángulo que impida la entrada de contaminantes con el aire Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa

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Pueden ser utilizadas para la obtención de cultivos puros Vertido Superficie Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa

Tinción –Simple Consiste en el uso de un solo colorante que aumenta el contraste del espécimen contra un fondo. –Diferencial Utilización de dos colorantes –(el colorante primario tiñe la estructura y el secundario ayuda al contraste). –Especial Los colorantes tienen afinidad específica por estructuras celulares Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa

ReactivosTiempoReacciones Frotis Cristal Violeta1 minutoColorante básico que se une a enjuagar los grupos cargados negativamente con aguade la pared celular, membrana, citoplasma. Yodo-Yoduro1 minutoYodo fija el cristal violeta a los grupos enjuagar negativos Alcohol-Acetona10 a 15 Decolorar el cristal violeta y yodo de segundoslas células. El color difunde de los enjuagarm.o. gram positivos más lentamente que con aguanegativos, por la composición química y grosor de la pared celular de gram positivos Safranina1 minutoColorante básico que se liga a los grupos enjuagar negativos en ambos tipos de células. Unos cuantos grupos negativos están libres del cristal violeta en gram +, mientras que la mayoría de los grupos - están libres en bacterias gram -. En consecuencia gram+ permaneces violetas mientras que gram -, rojos o rosas Células incoloras difíciles de ver Gram+ y -se tiñen azules Gram+ y - se mantienen azules Gram + permanecen azules, gram - se decoloran y son difíciles de ver Gram + las células permanecen violetas, mientrás gram - son teñidas a rosa o rojo.

Métodos rápidos Directos –Biofotometría –Conteo por microscopía electrónica –Marcaje por fluorescencia –Análisis de imágenes Indirectos –ATP por luminiscencia –Reducción de colorantes –Cromatografía de gases –Presencia de enzimas especificas –Componentes celulares ("fingerprinting")

Microscopía por fluorescencia Los microorganismos se concentración por filtración Se tiñen con un fluoroforo Se detectan en el microscopio con lámpara de mercurio para inducir la excitación del fluoroforo. Se realiza análisis de imágenes Es rápido (ca 2 horas) Puede ser utilizado para identificación

Esporas germinadas Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa Keiko Shirai: UAM-Iztapalapa

Bioluminiscencia (ATP) El ATP microbiano se hace reaccionar con la luciferasa Se realiza un análisis luminométrico El método es rápido (de 30 min a 2 horas) Se puede determinar viabilidad.

La ATP-Bioluminiscencia está basada en una reacción que ocurre en forma natural en las luciérnagas (Photinus pyralis). La reacción bioluminiscente catalizada por la luciferasa utiliza la energía química contenida en la molécula de ATP para producir la descarboxilización oxidativa de la luciferina a oxiluciferina, dando como resultado la producción de LUZ. La cantidad de luz emitida es proporcional a los niveles de microorganismos y/o materia orgánica presente.

Análisis de imágenes A. niger

GEOMETRIC MODEL The number of segments is a function of the number of tips. N S = 2N t – 1 11 = 2(6) – 1 Biomass is a function of the number of tips: X = N S [   d 2 L av /4] N S = 2 t t = 0; N S = 1 dN S /dt = ln(2)2 t+1 P3P3 P6P6 S0S0 P2P2 P4P4 P5P5 S1S1 S2S2 S6S6 S5S5 S4S4 S3S3 S10S10 S9S9 S8S8 S7S7 P1P1

HYPHAL GROWTH KINETICS X = [2*2 t -1][  d 2 L av /4] dX/dt = 2ln(2)2 t [  d 2 L av /4] (1/X)dX/dt = 2ln(2)2 t /[2*2 t -1]  For 2 t >>1; (1/X)dX/dt  ln(2)  µ X = X o e µt ; Find 

HYPHAL LENGTH vs TIME Glucosa: (g/L)  10; 40;  70; W120;  u 300 dL/dt = U r L/(K L + L) (empirical rate law)

FINDING BRANCHING TIME  dL/dt = U r L/(K L + L) (empirical law) U r = maximal rate of hyphal extension (cm/h) K L = empirical constant of saturation (cm) After integration, between L 0 and L C, the branching time, , is estimated as follows,  = [1/ U r ][K L ln(L C / L 0 ) +L C - L 0 ] = hours

APPROXIMATE MODELS For L C << K L  K L ln(L C / L 0 ) +L C - L 0  K L ln(L C / L 0 )   [1/ U r ][K L ln(L C / L 0 )] Early branching mechanism (Larralde model) For L C >> K L > L 0  K L ln(L C / L 0 ) +L C - L 0  L C   [1/ U r ][L C ] Late branching mechanism (Trinci model)

MICROSCOPIC MODELS Larralde-Corona et al., (1993); Lc << K L µ = ln(2)U R /[K L ln(L av /d 0 )]

PCR Extracción de ADN, este se amplifica en PCR Nucleótidos específicos son concentrados y reaccionan con reactivos fluorescentes para cuantificar Resultados son obtenidos en 1 a 3 horas Sensible.

Cromatografía de gases Se determinan ácidos grasos. No es un método rápido No es sensible

Kits Bioquímicos comerciales para la detección e identificación de patógenos

Componentes celulares (Molecular fingerprinting) Es una estrategia analítica para identificar metabolitos en una ruta ó para una clase de compuestos. Los resultados obtenidos pueden ser interpretados en términos de rutas metabólicas conocidas e interacciones fisiológicas.

Spectroscopy: Usually by direct injection without any chromatography step PCA: Principle Components analysis DFA: Discrimination Functional analysis Componentes celulares (Metabolic fingerprinting) X Y extraction