RCP digital por gotículas para la cuantificación rápida del ADN del donante en la circulación de receptores de trasplante como un posible biomarcador universal de lesión en el injerto J. Beck, S. Bierau, S. Balzer, R. Andag, P. Kanzow, J. Schmitz, J. Gaedcke, O. Moerer, J.E. Slotta, P. Walson, O. Kollmar, M. Oellerich y E. Schütz Diciembre de © Copyright 2013 by the American Association for Clinical Chemistry

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Introducción  ADN libre de células de injerto (GcfDNA)  Liberado por células apoptósicas del injerto.  Bajos porcentajes demográficos de cfDNA total.  Incremento en los porcentajes detectados durante el rechazo (1).  Métodos de cuantificación sensibles necesarios.  Secuenciación de nueva generación posible (1).  Desventajas: -Tiempos de obtención lentos y altos costos. -Los métodos descriptos requieren ADN genómico del injerto/donante. 1.Snyder TM, Khush KK, Valantine HA, Quake SR. Universal noninvasive detection of solid organ transplant rejection. (Detección universal no invasiva del rechazo al trasplante de víscera maciza). Proc Natl Acad Sci USA 2011;108:6229–34.

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Introducción  RCP digital por gotículas  Cuantificación absoluta precisa de moléculas modelo mediante separación de moléculas objetivo y estadísticas de recuento.  Cuantificación de GcfDNA mediante RCP digital por gotículas  Uso de SNP con alelos heterólogos en donante y receptor.  Panel preseleccionado con menores frecuencias alélicas > 0.4 ⇒ la mayor probabilidad para la condición de alelos heterólogos.

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Pregunta 1  ¿Cuál es la probabilidad de que un SNP (frecuencia alélica demográfica = 0.5) sea AA/BB o AA/AB en combinaciones de receptor/donante sin conexión?

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Materiales y métodos  Pacientes  Seguimiento de 8 pacientes luego del trasplante hepático (LTx).  Pacientes ambulatorios estables: n=10 LTx, n=8 trasplante cardíaco. (HTx), n=9 trasplante renal (KTx).  Extracción y preamplificación de cfDNA  Se extrajo el cfDNA de 1 ml de plasma ( equivalentes genómicos).  Preamplificación mediante el kit NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit (New England Biolabs).  RCP digital por gotículas  Mediante el sistema de ddPCR QX100 (Bio-Rad) conforme a las instrucciones del proveedor.  Aporte de ADN: 30 – 100 ng.

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Pregunta 2  ¿Por qué es necesaria la preamplificación de cfDNA?

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Principales resultados  Características de desempeño de los análisis de ddPCR  Imprecisión intranálisis: CV < 15 % (rango 4–14 %) a una concentración menor de alelos del 2% determinado por 13 análisis en una serie de 9 repeticiones en 1 serie.  Recuperación: 1.87 % (94 % del valor agregado) por sobre los 13 análisis de SNP, con una SD del 0.24 % (13 %).

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Figura 3. Los resultados de las genotecas de cfDNA preamplificado y la detección directa se muestran como cociente del resultado en muestras preamplificadas en relación con la medición del ADN genómico o cfDNA directo a partir de la misma extracción de sangre. Puede observarse que la preamplificación no introdujo sesgo al método de detección de SNP. Se suministran las relaciones de los cocientes del número de copias con SD. Principales resultados: Evaluación del sesgo de preamplificación Ratio of preamplified sample to cfDNA or gDNA: Cociente de la muestra preamplificada en relación con cfDNA o gDNA

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Figura 3. El primer paso de la detección utiliza RCP en tiempo real y ADN genómico del receptor. Se eliminaron todos los SNP con genotipos heterocigóticos en el receptor. El siguiente paso de selección utiliza ddPCR y cfDNA preamplificado como plantilla; aquí se define el conjunto de análisis informativo final para el paciente. Un análisis informativo detecta un SNP homocigótico en el receptor con un injerto de al menos un alelo heterólogo. Los porcentajes y las cantidades se calculan para una menor frecuencia alélica de 0.5 y puede variar entre pacientes individuales. Principales resultados: Secuencia de trabajo de la selección de análisis See slide 10 for Spanish translation of Fig.3

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Translation of Fig.3 Identificación de SNP homocigóticos en el paciente: 41 análisis realizados en el gDNA del paciente (20 ng) mediante RCP en tiempo real. Se excluye el 50 % (n20) de los análisis debido al genotipo heterocigótico en el receptor (AB). Se selecciona el 50 % de los análisis (n20 SNP con genotipo AA o BB en el receptor) para el segundo paso de detección en ddPCR con cfDNA preamplificado después del Tx. Se excluye el 25 % (n5) de los análisis debido al mismo genotipo homocigótico del receptor e injerto (AA/AA o BB/BB). El 50 % (n10) de los análisis homocigóticos en el receptor son heterocigóticos en el injerto (AA/AB o BB/AB). El 25 % (n5) de los análisis son homocigóticos en el injerto y heterólogos entre injerto y receptor (AA/BB o BB/AA). Conjunto de análisis informativo final para el paciente. La concentración de cfDNA del injerto se calcula a partir de al menos 2 análisis informativos independientes. Se excluyeron los valores atípicos con cifras de SD > 5 de la media.

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Principales resultados  cfDNA de injertos en muestras clínicas  Porcentaje de GcfDNA en pacientes estables < 10 %. -LTx: medio 3.5 % (1.0 % %). -KTx: medio 1.2 % (0.2 % %). -HTx: medio 0.9 % (0.1 % %). -Los mayores niveles de LTx reflejan un mayor volumen de injertos y una mayor tasa de regeneración de hepatocitos.  Cantidades muy altas ( ∼ 90 %) en las muestras obtenidas inmediatamente después de la revascularización.  Niveles de GcfDNA en pacientes sin complicaciones en un rango estable (< 15 %) después de los 10 días.

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Figura 4. GcfDNA medido en la circulación de 9 pacientes de KTx estables, 8 pacientes de HTx estables y 10 pacientes de LTx estables (valores medios y SD suministrados). El número de análisis de SNP con ddPCR usados para cada paciente se brindan debajo de la abscisa. Paciente s estables GcfDNA Cantidad de análisis

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Figura 5. La varianza en el patrón de reducción de GcfDNA observado en 3 pacientes de LTx durante los primeros días posteriores al trasplante. En un caso se presentó una rápida disminución, en otro una persistencia inicial a mayores valores, seguido de una marcada reducción ligeramente demorada, mientras que el tercer paciente (LTx8) demostró un aumento estable, aunque lento, de GcfDNA. Disminución de GcfDNA después del trasplante Días posteriores al LTx

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry  Principales resultados  Paciente con rechazo comprobado mediante biopsia el día 43. -Aumento gradual de GcfDNA con valores máximos marcados (día 38 y 58).  Paciente con rechazo tardío comprobado mediante biopsia el día Los niveles de GcfDNA se midieron el día 145 y se detectó su aumento (19 %).  Paciente con crisis de colestasis. -Aumento no específico de biomarcadores AST, GGT y bilirrubina. -El GcfDNA permanece en rango estable.  cfDNA de injerto durante el rechazo y crisis de colestasis

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Figura 6. La concentración de GcfDNA demostró un aumento marcado y estable desde el día 31 en adelante con un valor máximo inicial de aproximadamente el 60 % el día 38. Durante este período, el biomarcador convencional AST fue más variable. (Debe destacarse que la escala ordenada para el GcfDNA es diez veces mayor que en la Fig. 4). (B), Evolución temporal tardía del paciente de LTx3: se diagnosticó un rechazo agudo tardío el día 144 después de la cirugía. El porcentaje de GcfDNA fue del 19 % el día 145 y demostró un aumento pronunciado al 55 % el día 151. (C), Se muestra la evolución temporal tardía del paciente de LTx1, incluida una crisis de colestasis. Debe destacarse que el GcfDNA no aumentó a pesar de los aumentos en las pruebas funcionales hepáticas convencionales. Evolución temporal de GcfDNA durante eventos clínicos

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Translation of Fig.6 Biopsy-proven acute rejection - Rechazo agudo comprobado mediante biopsia Biopsy-proven chronic rejection - Rechazo crónico comprobado mediante biopsia AST (U/L) - AST (U/l) Bilirubin (mg/dL) - Bilirrubina (mg/dl) Days after LTx - Días posteriores al LTx AST Bilirubin GcfDNA Steroids Biopsies - AST Bilirrubina GcfDNA Corticoesteroides Biopsias Biopsy-proven acute rejection - Rechazo agudo comprobado mediante biopsia AST (U/L) - AST (U/l) GcfDNA (%) - GcfDNA (%) Days after LTx - Días posteriores al LTx AST (U/L)/GGT (U/L) - AST (U/l)/GGT (U/l) GcfDNA (%)/Bilirubin (mg/dL) - GcfDNA (%)/Bilirrubina (mg/dl) Days after LTx - Días posteriores al LTx AST - AST GGT - GGT GcfDNA - GcfDNA Bilirubin - Bilirrubina

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Pregunta 3  ¿Cuáles son las ventajas de la medición del ADN de injertos en comparación con la prueba convencional de la disfunción del injerto en receptores de trasplante hepático?

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry Conclusión  Se ha desarrollado una prueba rentable y novedosa de lesiones en injertos basada en ddPCR automatizada con un tiempo de obtención adecuado en el mismo día.  El GcfDNA investiga de forma directa la integridad de los órganos.  El GcfDNA se obtiene de la extracción simple de sangre, lo que permite una "biopsia de líquidos" más frecuente.  La prueba puede ser útil para controlar el tratamiento inmunodepresor óptimo.  Puede generar la reducción del riesgo de rechazo crónico al conducir a una intervención más puntual.

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