LA EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR DE LA TUBERCULOSIS: PRESENTE Y FUTURO FERNANDO CHAVES SERVICIO DE MICROBIOLOGÍA HOSPITAL 12 DE OCTUBRE

Reactivación endógena de una infección latente versus infección reciente Se suponía que en los países desarrollados la mayoría de los casos nuevos de tuberculosis se producían como resultado de reactivación endógena, solo un 10% eran resultado de transmisión reciente

Contribución de las técnicas moleculares al estudio de la transmisión de la tuberculosis Capacidad de discriminar entre aislados clínicos de Mycobacterium tuberculosis: “huella de ADN” o “genotipo”

Métodos de tipificación de M. tuberculosis Bacteriófagos Caracterización enzimática en biovariedades Tipificación molecular (1990- ) IS6110 IS1081 MPTR PGRS DR MIRU

Métodos de tipificación molecular de M. tuberculosis complex MÉTODO DE RFLP-IS6110 1º Cultivo de Mtbc (~3-6 semanas) 2º Extracción y purificación del ADN 3º Digestión con pvuII y electroforesis 4ºTransferencia del ADN (Southern Blot) 5º Hibridación con sonda complementaria a IS6110 y autoradiografia (~1 semana) VENTAJAS: -Técnica de “referencia” -Mayor discriminación LIMITACIONES: -Poca discriminación con 5 bandas -Comparación diferentes bases de datos NEJM 2003; 349: 1149-56

Huellas de ADN con IS6110 (patrones RFLP) de aislados clínicos de M Huellas de ADN con IS6110 (patrones RFLP) de aislados clínicos de M. tuberculosis de Madrid M J M J M

Dendograma y patrones RFLP de aislados clínicos de Mycobacterium tuberculosis multirresistentes

“Spoligotyping” MÉTODO DE SPOLIGOTYPING 1º Cultivo de Mtbc (~3-6 semanas) (posibilidad de realizar a partir de una muestra clínica) 2º Extracción del ADN (pequeña cantidad de ADN) 3º Amplificación por PCR 4º Hibridación en membrana (incluye 43 sondas) y autoradiografia (~3 días) VENTAJAS: - rapidez -interpretación y comparación de resultados LIMITACIONES: -menor discriminación NEJM 2003; 349: 1149-56

Spoligotyping de aislados clínicos de M. tuberculosis complex

Resultados de la tipificación molecular mediante RFLP-IS6110 y spoligotyping J. of Internal Med. 2001; 249: 1-26

El método molecular más utilizado: RFLP con IS6110. CONTRIBUCIÓN DE LA EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR AL ESTUDIO DE LA TRANSMISIÓN DE LA TUBERCULOSIS El método molecular más utilizado: RFLP con IS6110. Las técnicas moleculares identifican transmisión Casos no relacionados epidemiológicamente --> cepas de Mtbc con diferente patrón de ADN Casos relacionados --> cepas con idéntico patrón de ADN Estudios poblacionales: Casos con el mismo patrón --> casos en clusters --> interpretación: “transmisión reciente” Casos con patrón único --> “reactivación de infección antigua”

¿Que ha aportado la epidemiología molecular en estos últimos años? 1) Transmisión de la TB 2) Manejo clínico 3) Virulencia y transmisibilidad 4) Evaluación de los Programas de control de la enfermedad

1) Transmisión de la TB Confirmar brotes sospechados en los estudios epidemiológicos Cuantificar el número de casos en clusters, que pudieran ser atribuidos a “transmisión reciente”, en un área determinada Identificar “nuevas rutas” de transmisión de la TB y casos no sospechados en los estudios epidemiológicos Identificar grupos de riesgo implicados en la transmisíon

COMPARACIÓN DEL DISEÑO Y PRINCIPALES RESULTADOS EN DIFERENTES ESTUDIOS DE EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR REALIZADOS EN GRANDES CIUDADES

Algunas “rutas de transmisión” TB en hospitales: cepas sensibles y multirresistentes: en pacientes VIH + y - TB en prisiones, y entre población penitenciaria y general TB en personas sin hogar Transmisión entre diferentes paises y continentes TB: contacto esporádico en lugares de ocio, receptores de transplante, sala de autopsia, cabina de avión,...

FACTORES DE RIESGO ASOCIADOS A LA PERTENENCIA A CLUSTERS EN DIFERENTES ESTUDIOS REALIZADOS EN CIUDADES DE PAÍSES DESARROLLADOS

Interpretación de los resultados de la epidemiología molecular en los estudios poblacionales Duración del estudio Técnica molecular utilizada e interpretación del resultado Edad de la población Proporción de casos de TB incluidos en el estudio molecular Incidencia de TB en la población de estudio Estabilidad de los patrones de ADN y evidencia de reactivación después de varias décadas de la infección inicial (JID 2003; 188: 1032-1039)

Factores que dificultan el control de la transmisión de la tuberculosis Un alto porcentaje de casos se producen como resultado de un contacto esporádico con un caso de TB (lugares de ocio, trabajo, etc. ) La transmisión ocurre probablemente antes del tratamiento antituberculoso “retraso en el diagnóstico y tratamiento”

¿QUÉ APORTA EL ESTUDIO MOLECULAR A LA EPIDEMIOLOGÍA CLÁSICA? Identifica casos agrupados que no se pensaba que pudieran pertenecer a la misma cadena de transmisión. Permite responder más adecuadamente a la pregunta de cuántos casos se deben a reactivación y cuántos a infección reciente. Permite identificar patrones de transmisión en distintos subgrupos poblacionales y los lugares en que ésta se produce.

Epidemiología convencional “Las técnicas moleculares no vienen a sustituir a la epidemiología clásica” Epidemiología convencional + Técnicas moleculares

2) Manejo clínico Diferenciar recaída de reinfección: Reinfección exógena por una cepa S o R Reinfección exógena en pacientes inmunodeprimidos en pacientes VIH + por cepas de Mtb R en pacientes en prisión y VIH + por cepas de Mtb S Reinfección exógena en estudios poblacionales: población inmunodeprimida e inmunocompetente Reinfección exógena en un área con moderada incidencia de TB (Las Palmas de Gran Canaria). 1991-1996: 8/18 (AJRCCM 2001; 163: 717-20) Reinfección exógena en un área con alta incidencia de TB (Sudafrica) 1992-1998: 12/16 (NEJM 1999; 341: 1174-79) Implicaciones clínicas y epidemiológicas ante la posibilidad de reinfección exógena

2) Manejo clínico Casos de TB falsos-positivos errores con la muestra / contaminaciones en el “laboratorio” algunos estudios han detectado hasta un 4% ¿en que casos se sospecha un falso positivo de TB? un único cultivo + (escaso) repetidas baciloscopias negativas cuadro clínico no compatible con TB La deteccion de la “huella de ADN” de este aislado confirmaba la sospecha de falso-positivo Consecuencias clínicas, epidemiológicas y económicas

3) Virulencia y transmisibilidad de Mtbc ¿las cepas de Mtbc son igualmente de virulentas? Transmisión de algunas cepas “hipervirulentas”: transmisión de la cepa MTB-S (CDC1551): produjo un gran número de casos los lipidos de la pared micobacteriana producían una mayor respuesta de citoquinas mayor patogenicidad en el modelo de ratón Cepa 210 de Mtb (derivada de la familia Beijing): cepa diseminada en diferentes lugares de EEUU crece más rapidamente en el modelo del macrófago humano Emergencia de una cepa de la familia Beijing en la Isla de Gran Canaria (AJRCCM 2001; 164: 1165-70)

3) Virulencia y transmisibilidad de Mtbc Transmisión de cepas resistentes: resistencia y patogenicidad Tema controvertido Transmisión en EEUU (Nueva York) de la cepa multirresistente “W” (1990-93) Transmisión en España de una cepa de M. bovis multirresistente Mutaciones en el gen katG (posición 315) (INH-R) y virulencia de Mtbc: asociación con alta R a INH, multirresistencia y transmisión JID 2000; 182: 1788-90 Infect. Immun. 2002; 70: 4955-60

3) Virulencia y transmisibilidad de Mtbc Persistencia de una cepa de MTBC multiR (“W”) en Nueva York (1990-1993 y 1993-1999) Los casos del 2º periodo eran menos probable ser VIH, nacidos en EEUU, “sin hogar”, antecedentes de carcel, y tener conexiones epidemiológicas. Los casos del 2º periodo probablemente representen reactivaciones en individuos infectados durante el periodo de brote. JID 2003; 188: 356-63

4) Evaluación de los Programas de control de la enfermedad Estudio poblacional de epi molecular en San Francisco para evaluar la eficacia de las medidas tomadas para el control de la TB (1991-1997) tras la intensificación de las medidas preventivas:  tasa de TB de 51,2 a 29.8 casos/100.000  proporción de casos en “clusters” en general  de casos en clusters en personas nacidas en EEUU  de casos en clusters en VIH + % de pacientes en cluster como indicador Ann Intern Med 1999; 130: 971-8

Retos para el futuro Desarrollar estrategias que Integren la epidemiología molecular en los Programas de prevención y control de la enfermedad identificar grupos de riesgo mejorar los estudios de contactos identificar puntos débiles en los programas de control evaluación de los programas Técnicas moleculares más rápidas y fácilmente comparables por los distintos laboratorios