Nuevas técnicas de detección de poblaciones minoritarias en infección por VIH: posibles usos y limitaciones Rafael Delgado Laboratorio de Microbiología.

Presentación del tema: "Nuevas técnicas de detección de poblaciones minoritarias en infección por VIH: posibles usos y limitaciones Rafael Delgado Laboratorio de Microbiología."— Transcripción de la presentación:

1 Nuevas técnicas de detección de poblaciones minoritarias en infección por VIH: posibles usos y limitaciones Rafael Delgado Laboratorio de Microbiología Molecular Hospital Universitario 12 de Octubre. Madrid

2 VIH: Mutaciones de Resistencia
VIH evoluciona rápidamente: Alta replicación Alta tasa de mutación Reversión a WT en ausencia de ARV: Frecuencia de mutaciones disminuye Pueden no ser detectadas por Secuenciación convencional Mutaciones minoritarias pueden rápidamente conducir a fallo terapéutico?

3 Información insuficiente sobre:
Transmisión e inicio de la infección Relación entre resistencia y transmisión Consecuencias de mutaciones de resistencia de bajo nivel Transmisión de resistencias por naïve?

4 Secuenciación poblacional solo detecta frecuencias > 20%
377

5 Nuevas técnicas de genotipado
PASS: Parallel Allele-Specific Sequencing SGS: Secuenciación de genomas individuales AS-PCR: PCR alelo-específica Pirosecuenciación: Ultra-deep sequencing

6

7 SGS/SGA: Secuenciación de Genomas Únicos
Concentración RT-PCR ultrasensible Dilución límite Secuenciación individual de clones Análisis filogenético

8 SGS/SGA + 1/3 1/9 1/27 ~ 30%+ + + + + - 377 - + + + - - - - +

9

10 AS-PCR

11 Mutaciones añadidas utilizando AS-PCR
Mutación Frecuencia convencional vs AS-PCR Incremento L90M 8% → 11% +25% M41L 9% → 17% +70% K70R 9% → 14% +60% K103N 19% → 20% +5% Y181C 3% → 8% +260% M184V 8% → 10% +23% T215Y 17% → 20% +20% T215F 2% → 7% +340% Johnson J. 14th CROI, Los Angeles 2007, #61

12 Mutaciones añadidas utilizando AS-PCR
N=155 nuevos diagnósticos % Total con mutaciones % con mutaciones a NNRTI Mutaciones primarias por Genotipado convencional 10,4 3,9 + AS-PCR (K103N) 13,6 7,1 Marin L at al. Reunión SEIMC 2007

13 Importancia clínica de las mutantes resistentes minoritarias de VIH-1
Clinicamente relevantes: Johnson J. 14th CROI, Los Angeles 2007, #61 CNA 30021/30024: EFV/3TC + ABC or ZDV AS-PCR para K103N , Y181C and M184V Fracaso Virológico en 7/9 con variantes minoritarias Riesgo de fracaso con variantes minoritarias x 11 (p=0.004) Clínicamente NO relevantes: Peuchant et al. 14th CROI, Los Angeles 2007, #666 AS-PCR: Las mutaciones mayoritarias pero no las minoritarias modifican la respuesta a ART

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25 Respuesta al tratamiento y mutaciones minoritarias
Estudio FIRST: NRTI + (PI)/(NNRTI)/(PI+NNRTI) Mutaciones NNRTI Trat: + NNRTI: Fallo virológico a los 12 meses: 72,7% con muts 28,0% sin muts Mutaciones RT Trat: + NNRTI: Fallo virológico a los 12 meses: 59,1% con muts 24,8% sin mut Kozal et al 16th Intl HIV Drug Resistance Workshop, Barbados 2007

26 Nuevas técnicas de genotipado
Experiencia Sensibilidad Coste Linkage y Filogenia PASS ? +++ $$$ + PiroSeq ++ SGS $$ AS-PCR $