RING TEST FOR A WHOLE-SEDIMENT TOXICITY ASSAY WITH THE BENTHIC MARINE DIATOM Cylindrotheca closterium Instituto de Ciencias Marinas de Andalucía (ICMAN) Cristiano V.M. Araújo Julián Blasco Ignacio Moreno-Garrido EXERCICIO INTERLABORATORIO DUN ENSAIO DE TOXICIDADE CON SEDIMENTO USANDO A DIATOMEA Cylindrotheca closterium

destino final de contaminantes: impacto urbano e industrial destino final de contaminantes: impacto urbano e industrial sumidero / fuente de contaminantes y nutrientes sumidero / fuente de contaminantes y nutrientes biodiversidad funcionamiento biodiversidad funcionamiento Sedimentos estuarinos elutriatos y agua intersticial sedimento sedimento Calidad ambiental del sedimento

Representante del microfitobentos Relevancia elevada: productor primario Relevancia elevada: productor primario Importante en el ciclo de materia y energía, producción de oxígeno, estabilización del sedimento Importante en el ciclo de materia y energía, producción de oxígeno, estabilización del sedimento Alta sensibilidad Alta sensibilidad Cylindrotheca closterium (diatomea) ORGANISMO DE ENSAYO Microalgas - organismos de ensayo Selenastrum capricornutum Phaeodactylum tricornutum Sedimento - organismos bentónicos

OBJETIVOS Evaluar y optimizar el ensayo de toxicidad en sedimento usando Cylindrotheca closterium para aplicación en programas de calidad ambiental de sedimentos marinos y costeros. Evaluar la viabilidad y variabilidad (intra e interlaboratorial) del método.

La draga es hundida en el sedimento Sedimento superficial aislado por la tapa Ría de Huelva

Muestras de sedimento Cepa de microalga Soluciones: cultivo y ensayo

Cepa de microalgasMedio de cultivo Añadir agua Milli-Q, NaCl, NaSO 4, solución stock 01 y 02, medio f/2 y silicato Aclimatarlas a temperatura ambiente Renovar el cultivo después de la 1ª (cultivo 02) y 2ª (cultivo 03) semanas. Cultivo 01: Incubar Verte el contenido de las pipetas

Medio del ensayoFrascos del ensayo Añadir agua Milli-Q, NaCl, NaSO 4, solución stock 01 y 02, solución nutritiva y silicato Añadir 2 g de peso seco sedimento y 48 mL de medio El día siguiente Cultivo 03 (crecimiento exponencial) Centrifugar y lavar el cultivo con el medio de ensayo Inóculo concentrado Añadir las algas Incubar - al final de 72 h, hacer el recuento celular Frascos del ensayo Ensayo de toxicidad

RESULTADOS Densidad celular final de poblaciones de Cylindrotheca closterium tras 72h de exposición a cuatro muestras de sedimento. Los ensayos representan diferentes laboratorios. Ds: nº de células en el control al final del ensayo Dc: nº de células en la muestra test Di: nº de células inicial (1x10 4 cels mL -1 ) Densidad celular tras 72 h (cels mL -1 ) x 10 4 Ensayos

RESULTADOS Intervalo entre el 2º y 3º cuartiles Inhibición de crecimiento (%) de células de Cylindrotheca closterium expuestas al sedimento A. Mediana SD de los 3 valores centrales

RESULTADOS Intervalo entre el 2º y 3º cuartiles Inhibición de crecimiento (%) de células de Cylindrotheca closterium expuestas al sedimento B. Mediana SD de los 3 valores centrales

RESULTADOS Intervalo entre el 2º y 3º cuartiles Inhibición de crecimiento (%) de células de Cylindrotheca closterium expuestas al sedimento C. Mediana SD de los 3 valores centrales

RESULTADOS Replicabilidad y reproducibilidad (en %) del porcentaje de inhibición de crecimiento obtenido para cada laboratorio y muestra. Muestras EnsayoRaRa R’ b (CV en %) A-c-c 4.28> B > C a: R representa la reproducibilidad calculada con todos los datos. b: R’ representa la reproducibilidad calculada sin el datos del ensayo #3. c: No hubo crecimiento celular en ninguna de las réplicas.

RESULTADOS Xlab: resultado de un laboratorio. X: mediana de los resultados de todos los laboratorios (excepto ensayo #3). IQR(n): rango intercuartil (diferencia entre los cuartiles superiores (75%) e inferiores (25%) normalizado (multiplicado por factor sacado a partir de la distribución normal de los datos). Z ≤ 2: satisfactorio 2 < Z ≤ 3 aceptable (cuestionable) Z > 3 insatisfactorio

CONCLUSIONES El ensayo propuesto ha sido valorado positivamente por todos los laboratorios pese la falta de experiencia con el organismo usado; El ensayo propuesto ha sido valorado positivamente por todos los laboratorios pese la falta de experiencia con el organismo usado; Alrededor del 80% de los ensayos (17 de 21) presentaron resultados considerados satisfactorios (Z score ≤ 2); Alrededor del 80% de los ensayos (17 de 21) presentaron resultados considerados satisfactorios (Z score ≤ 2); La practicidad y relevancia del ensayo, y la buena reproducibilidad (pequeña variabilidad) de los resultados favorece a la implementación del ensayo con Cylindrotheca closterium expuesta a todo el sedimento como método estándar para evaluar la calidad del sedimento estuarino. La practicidad y relevancia del ensayo, y la buena reproducibilidad (pequeña variabilidad) de los resultados favorece a la implementación del ensayo con Cylindrotheca closterium expuesta a todo el sedimento como método estándar para evaluar la calidad del sedimento estuarino.

A G R A D E C I M I E N T O S PROYECTO

Instituto de Ciencias Marinas de Andalucía (ICMAN) Cristiano V.M. Araújo Julián Blasco Ignacio Moreno-Garrido RING TEST FOR A WHOLE-SEDIMENT TOXICITY ASSAY WITH THE BENTHIC MARINE DIATOM Cylindrotheca closterium EXERCICIO INTERLABORATORIO DUN ENSAIO DE TOXICIDADE CON SEDIMENTO USANDO A DIATOMEA Cylindrotheca closterium