MALDI-TOF MS y Análisis de Proteínas Curso Espectrometría de masas, Electrospray Trampa Iónica y Maldi-Tof UNIVERSIDAD FRANCISCO DE VITORIA MALDI-TOF MS y Análisis de Proteínas Alberto Jorge García Laboratorio de Proteómica Centro de Biología Molecular Severo Ochoa Universidad Autónoma de Madrid- CSIC

Oferta del Servicio de Proteómica Análisis mediante Espectrometría de Masas Identificación sistemática de proteínas presentes en las bases de datos a partir de geles La Síntesis de Péptidos y la Secuenciación de Edman son servicios independientes

Servicio de “Proteómica” Digestión manual en gel Análisis mediante MALDI-TOF: Obtención del mapa peptídico e identificación mediante huella peptídica (PMF) Análisis mediante LC-ESI-IT Buen mapa con mezcla de proteínas: Exclusión dinámica (DE), búsqueda en DB mediante TurboSequest Mapa pobre ó interés en uno ó varios péptidos determinados: Monitorización de iones sencillos (SIM), búsqueda en DB por Tsequest ó confirmación mediante predicción teórica de fragmentación

Equipos disponibles Un espectrómetro de masas tipo MALDI-TOF, modelo Autoflex de Bruker, equipado con reflector y sistema para PSD Un espectrómetro de masas de trampa iónica modelo LCQ Classic de Thermo Finnigan, equipado con sistemas de ionización de nanospray y microspray de fabricación propia, acoplado a una bomba de HPLC Beckman Gold controlada por un ordenador IBM PS2 de 500K de RAM y un restrictor de flujo Accurate de LCPackings Interface “metal needle kit” para el acoplamiento LC-ESI-IT regalada por Thermo Finnigan y columna RP de 180 mm

Procedimiento de trabajo Recepción y control de muestras Aviso previo a la entrega de geles Escaneo del gel, Confección de ficha de usuario, Asignación de fichero Instrucciones del trabajo a realizar Análisis Digestión manual en gel Obtención del mapa peptídico mediante MALDI-TOF Análisis mediante LC-ESI-IT (centrado en Proteómica)

Requisitos para la preparación de geles y digestión Reactivos Manipulación Confección del gel Tinción (Coomassie/Imidazol-Zn, Sypro-Ruby,plata) Digestión en gel Procedimiento adaptado de Mann y cols optimizado para portamuestras de Bruker Control interno de contaminación y eficiencia y externo de eficiencia

Identificación mediante PMF Tres niveles de preparación de muestras: Sensibilidad normal (Coomassie): método estándar Alta sensibilidad: método “anchorchip” con matriz HCCA y cristalización homogénea de Bruker Muy alta sensibilidad (Coomassie, Sypro-Ruby, Plata): método “anchorchip” con matriz DHB y cristalización heterogénea (método sin publicar)

Identificación mediante PMF Métodos de calibración: “close-external” para búsquedas en DB con 100-150 ppm mediante “zonas prohibidas” (*) para búsquedas con 50-100 ppm interna de forma manual, mediante macro ó software (*) para búsquedas con 30-50 ppm Motores de búsqueda: Internet (Mascot, Profound) Motor de desarrollo propio (*) * Campillo, Martín and Vázquez (en preparación)

Identificación Proteína Identificación Péptido Proteómica: Péptidos Proteoma BASE DE DATOS Fragmentos BASE DE DATOS Proteína Identificación Péptido

ESTRATEGIA INTEGRADORA PARA EL ANÁLISIS DEL PROTEOMA SDS-PAGE Digestión “in situ” en paralelo Bandas de proteínas 2D-IEF-SDS-PAGE Extracto de péptidos mapa de péptidos MALDI-TOF Identificación de proteína m-desalado automático aislamiento y fragmentación Secuenciación “de novo” Electrospray-trampa iónica

Mapa de péptidos (MALDI-TOF) Extracto crudo digestión “en gel” Intensidad m/z

Identificación de la proteína a partir del mapa de péptidos (“peptide-mass fingerprinting”) Búsqueda en MASCOT (D.Pappin, ICRF, Londres) 1. gi|191618 Mass: 223549 Score: 87 (M76598) alpha cardiac myosin heavy chain [Mus musculus] Observed Mr(expt) Mr(calc) Delta Start End Miss Peptide 1061.02 1060.01 1060.13 -0.12 1366 - 1374 0 ANSEVAQWR 1085.02 1084.01 1084.32 -0.31 436 - 443 0 MFNWMVTR 1239.27 1238.26 1238.28 -0.01 1253 - 1262 0 TLEDQANEYR 1346.49 1345.48 1345.52 -0.04 24 - 34 0 LEAQTRPFDIR 1442.63 1441.62 1441.61 0.02 1680 - 1691 0 NNLLQAELEELR 1489.17 1488.16 1488.57 -0.41 1117 - 1128 0 IEELEEELEAER 1602.80 1601.79 1601.82 -0.02 955 - 968 1 DIDDLELTLAKVEK 1703.76 1702.75 1702.90 -0.14 1423 - 1436 0 LQNEIEDLMVDVER 1741.93 1740.92 1740.98 -0.06 726 - 741 0 ILNPAAIPEGQFIDSR 1840.03 1839.02 1838.99 0.03 1179 - 1195 0 DLEEATLQHEATAAALR 1896.08 1895.07 1895.02 0.06 1198 - 1214 0 HADSVAELGEQIDNLQR 1979.38 1978.37 1978.18 0.19 1620 - 1636 0 MEGDLNEMEIQLSQANR 2107.39 2106.38 2106.35 0.03 1619 - 1636 1 KMEGDLNEMEIQLSQANR 2277.72 2276.71 2276.54 0.17 1063 - 1081 1 LTQESIMDLENDKLQLEEK 2343.63 2342.62 2342.42 0.20 887 - 906 0 NDLQLQVQAEQDNLNDAEER 2809.57 2808.56 2809.04 -0.48 1000 - 1024 1 ALQEAHQQALDDLQAEEDKVNTLTK 2837.05 2836.04 2836.07 -0.02 1654 - 1678 1 DTQLQLDDAVHANDDLKENIAIVER No match to: 1771.94

MALDI-TOF: How’s It Work? 5.They drift (or fly) down a field free flight tube where they are separated in space. 6. Ions strike the detector at different times, depending on the mass to charge ratio of the ion. 1. Sample is mixed with matrix & dried on sample plate 4. Ions are accelerated by an electrical field to the same kinetic energy el 20 - 30 kV Flight tube High vacuum 2. Target is introduced into high vacuum of MS High voltage 3. Sample spot is irradiated with laser, desorbing ions into the gas phase and starting the clock measuring the time of flight. Pulsed laser Time 7. A data system controls all instrument parameters, acquires the signal vs. time, and permits data processing.

MALDI-TOF/MS Time-of-Flight Molecular Mass Laser Sample Target Clock Detector Time-of-Flight Molecular Mass

MALDI-TOF/MS matrix analyte sample solution dry samples sample deposition insert target and perform analysis

Ionización/Desorción Matrix for Proteins: sinapinic acid, dihydroxybenzoic acid etc. Matrix for Peptides: 4-hydroxy-a-cyanocinnamic acid, DHB. it co-crystallizes, absorbs laser energy, evaporates and acts as acid

Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization (MALDI) + Cationized analyte Analyte molecules Matrix molecules Laser beam Matrix molecules Matrix ions -explicar -prob choque dos veces con matriz es muy baja: carga 1 -dos características fundamentales: pulsante y carga 1+ -eficiencia depende de razón analito/matriz y forma de cristalización Cortesía de Bruker Daltonics

Tres niveles de preparación de muestras: Sensibilidad normal: método estándar. Alta sensibilidad: método “anchor-chip” con matriz HCCA y cristalización homogénea de Bruker. Muy alta sensibilidad: método “anchor-chip” con matriz DHB y cristalización heterogénea.

Preparación de la muestra: anchor-DHB

Fundamentos del TOF -todo lo que entra se ve: alta eficiencia detección -potencialmente mucha resolución: depende de fuente de iones -comentar reflector, extracción pulsante

MALDI-TOF Linear detector Reflector detector Laser Reflector Source

Resolución isotópica

Voltaje de extracción

Extracción retardada

Extracción retardada

Decomposition occurs in the flight tube Linear detector Reflector detector Laser Decay can occur at any point along here Reflector Source

Fundamentals of PSD PSD refers to a method of detecting and measuring the masses of fragment ions formed from a selected precursor ion during the flight time. Fragment ions are mainly formed by unimolecular decomposition after the precursor ions are fully accelerated (after they exit the source—hence post-source decay) Fragment ions are separated in the reflector.

PSD fragment ion velocities are the same as their precursors + All three of these species travel at the same velocity in the flight tube until they reach the mirror. + Why? Velocity is determined by initial acceleration. Initial energy = 20 keV. Bond energies = ~ 10 eV, so breaking a bond has a very minor effect on velocities.

Neutral fragments are not detected Reflector detector Fragmented precursor ion + + 0 V. +20 kV Reflector

Fragment ions take different paths in the reflector Reflector detector Intact precursor ion + + Fragment ion formed by PSD 0 V. +20 kV Reflector

PSD ISD