TECNICAS DE IDENTIFICACIÓN DE ANTICUERPOS Hematologia 2012

INMUNOFLUORESCENCIA Identificar y localizar Ag en el interior o superficie de la célula Fluoresceina fijado a una molécula de Ac Métodos directos e indirectos Actualmente :CMF:cuantificar hemorragia maternofetal,identificar cél transfundidas y seguimiento de la supervivencia

ENZIMOINMUNOANÁLISIS Medir Ag o Ac Fosfatasa alcalina puede unirse a moleculas de Ac sin destruir su especificidad Utilizada para unir Ig unida a GR y demostrar hemorragia fetomaterna

PRUEBA DE ADHERENCIA DE GR EN FASE SÓLIDA PRUEBA DIRECTA: Ac fijado a la microplaca y se agregan GR (+) GR se adhieren a los bordes (-) GR se asientan en los bordes PRUEBA INDIRECTA GR con Ag conocido unidos a una placa pretratada con glutaraldehido y poli-lisina, Ac especifico Se agrega suero ,incubar,lavar proteinas remanentes Indicador para el Ac fijado GR recubiertos con IG Interpretación : Idem

PRUEBA DE ADHERENCIA DE GR EN FASE SÓLIDA

PRUEBA DE GEL Utiliza microtubos contenidos en una tarjeta de gel.Este formato permite la centrifugación simultánea de los tubos(6) en equipos especialmente diseñados La incubación del Ac con los GR en suspención se realiza en la parte superior del tubo ,luego se centrifuga para que los GR entren en contacto con el As que baña el gel Los geles actúan como filtro,reteniendo los aglutinados y dejando pasar los GR libres que se depositan en el fondo

EXISTEN 3 FORMULACIONES BÁSICAS DEL GEL Gel neutro: Solo contiene la matriz del gel-sephadex para detección deaglutinados producidos por Ac aglutinantes Prueba inversa ABO,investigación de Ac frios y pruebas enzimáticas

Gel especifico: Mezcla de gel-sephadex contra un Ag de gr sanguineo Determinación de Gr sanguineo Gel antiglobulina: Se usa en la P de Coombs para identificar Ac antieritrocitarios incapaces de producir aglutinación directa

Puede ser utilizado para detectar e identificar Ags y Ac,pruebas de compatibilidad pretransfusional En los tubos que contiene el panel ABO,el gel está en medio salino,mientras que en los del panel selector está en reactivo de Coombs VENTAJAS: Puede efectuarse técnicas en ½ salino, enzimático,antiglobulinico Es automatizable DESVENTAJAS: Costo y equipamiento

Partículas de gel :filtros que atrapan los aglutinados Aglutinados grandes:Parte superior Aglutinados pequeños: Parte Inferior No aglutinados :extremos en pico APLICACIONES: Detectar e identificar Ac o Ag Pruebas de compatibilidad

Prueba Funcional: ERITROFAGOCITOSIS En 3 portaobjetos colocar 1,5 ml. de sangre del paciente recién extraída e incubar durante 60 minutos a 37C en cámara húmeda. Retirar el coágulo formado y lavar las células obtenidas por su capacidad de adherirse al vidrio con una solución de Hanks a 37C. Preparar las siguientes suspensiones al 5% en solución fisiológica: a) Hematíes Propios (HP) b) Hematíes Normales (HN) d) Hematíes Normales Sensibilizados (HNS) con anti-D (clase IgG) diluido convenientemente.

A 2,5 ml de las mismas agregar 1 ml de suero humano fresco compatible y 1,5 ml de solución de Hanks. Incubar los portaobjetos con 1 ml de cada una de estas mezclas durante 3 hs. a 37C en cámara húmeda. Posteriormente lavar con solución de Hanks a 37C. Fijar las células mononucleares obtenidas con metanol durante 1 minuto y colorear con la tinción de May Grunwald Giemsa. Realizar la observación microscópica de los preparados contando 200 elementos y calcular los porcentajes de células fagocíticas activas (CFA). Valor normal < 4%.

GRs adheridos GR fagocitado CFA Imágenes de eritrofagocitosis

PARA LA IDENTIFICACIÒN DE Ac TÈCNICAS ESPECIALES PARA LA IDENTIFICACIÒN DE Ac -INHIBICIÒN DE LA HEMAGLUTINACIÒN: Neutraliza un Ac especìfico con su sustancia soluble correspondiente en las pruebas de identificaciòn de Ac ( ùtil cuando se trabaja con muestras sèricas que contienen mùltiples especificidades) TRATAMIENTO ENZIMÀTICO: Se utilizan para tratar Gr con el fin de potenciar cierta reactividad de Ac o proporcionar una mas efectiva adhesiòn de Ac en los procedimientos de autoadsorciòn POTENCIACIÒN DE LA REACTIVIDAD La potenciciòn de la reactividad Ac con cèlulas tratadas enzimàticamente se demuestra en los sistemas: Rh, Kidd; Lewis, Ii, P DESTRUCCIÒN DE LA REACTIVIDAD: El tratamiento Ez puede tambien usarse par destruir la reactividad de los Ag: M, N, Fya, Fyb, Pr, Cha, Rga

Proceso utilizado para la eliminaciòn de Ac unidos a hematies: ADSORCIÒN: Proceso utilizado para eliminar Ac del suero, se pueden utilizar Gr lavados, tratados enzimàticamete,o estromas eritrocitario *Eliminaciòn de auto Ac frios o calientes: generalmente se utilizan Gr autòlogos para la adsorciòn *Eliminaciòn de Aglutininas ABO no necesarias: esto puede hacerse en la preparaciòn de antisueros puros ELUCIÒN: Proceso utilizado para la eliminaciòn de Ac unidos a hematies: 1º se lavan las cèlulas con SF,para eliminar cualquier Ac no unido. Mètodos: *Por calor( disocia el Ac de los Ag eritrocitarios :56-60ºC durante 10 min efectivo para los Ac IgM *Congelaciòn /descongelaciòn: bueno para la disociaciòn de las IgM *Solventes orgànicos: Eter ,etanol , cloroformo, xileno : Para la IgG *Eluciòn àcida con Digitonina y Glicina: (por alteraciòn del Ph)

Aplicaciones :en estudios prenatales -TITULACIÒN DE Ac: Es un mètodo para determinar semicuatitativamente la cantidad de Ac presente en un suero determinado El tìtulo se expresa como la recìproca de la diluciòn sèrica mas alta que provoca la aglutinaciòn macroscòpica Aplicaciones :en estudios prenatales UTILIZACIÒN DE REACTIVOS SULFHIDRILOS: El 2ME rompe los enlaces disulfuros y son utilizados para inactivar la capacidad de aglutinaciòn de las IgM, destruyendo la estructura pentamèrica de la IgM .Son ùtiles para investigar las IgG clìncamente significativa en presencia de un autoAc y para la deteminaciòn de ABO y Rh en presencia de un autoAc frìo PRUEBAS PARA Ag ERITROCITARIOS Cuando el paciente tiene un Ac complicado a veces es ùtil tipificar los Gr del paciente para los otros Ag de grupo sanguineo frecuentes para determinar de que Ag carece el paciente y tener informaciòn sobre que Ac podrìa formar el paciente

CONSIDERACIONES GENERALES -FUENTE DE REACTIVOS : Antisueros :Plasmas extraido de donates que fueron inmunizados por transfusiòn o embarazo o animales inmunizados con Ag purificados . Se debe ensayar el antisuero para especificidad , avidez y tìtulo ANTICUERPOS MONOCLONALES ; Son sintetizados por Hibridomas linfocitarios (fusiòn de celulas productoras de AC de animales y cèlulas neoplasicas) Los Ac monoclonales se diferencian de los Ac convencionales por la especificidad ( reaccionan con uno en vez de con mùltiples determinantes antigènicos.) el grado de pureza y reproductibilidad Algunos reactivos derivados de Ac monoclonales murinos:anti A, anti B, antiH, Anti M, anti N, anti Lewis , anti P y los de origen humano:antiD, anti C, anti E , antic LECTINAS: contiene proteinas receptoras que reaccionan con carbohidratos de la membrana del Gr para causar hemaglutinaciòn

¡GRACIAS!