ANTICUERPOS MONOCLONALES HEMOCLASIFICADORES Lic. René A. Rivero Jiménez, MSc. INSTITUTO DE HEMATOLOGIA E INMUNOLOGIA

SISTEMAS DE GRUPOS SANGUÍNEOS DE MAYOR IMPORTANCIA CLÍNICA ABO RH

1901: Primer sistema descubierto por Karl Landsteiner Sistema ABO 1901: Primer sistema descubierto por Karl Landsteiner Solo dos antígenos, A y B podían explicar la existencia de 4 grupos: A, B, AB, O Pero los antígenos A y B son el resultado del funcionamiento sinergístico de dos sistemas genéticos independientes: El Hh, donde el gen activo H (cromosoma 19) crea una enzima que funciona añadiendo azúcares a un substrato precursor, antes de la acción de los genes A y B (cromosama 9)

N-acetilgalactosamina Sistema ABO Antígeno H Antígeno A Antígeno B Ceramida Glucosa Galactosa N-acetilglucosamina N-acetilgalactosamina Fucosa

Sistema ABO Genotipos Fenotiposa Anticuerpos Glucosiltransferasas Eritrocitos Suero Genotipos Fenotiposa Anticuerpos Glucosiltransferasas A1A1, A1A2, A1O A1 Anti-B -3-N-acetilgalactosaminil A2A2, A2O A2 Anti-Bb -3-N-acetilgalactosaminilc BB, BO B Anti-A -3-galactosil A1B A1B --- -3-N-acetilgalactosaminil y -3-galactosil A2B A2B ---b -3-N-acetilgalactosaminil OO O Anti-A y Anti-B ---- Leyenda: aDefinido por antisueros anti-A, anti-B, y anti-A1. bAnti-A1 algunas veces presente en el suero de individuos de los grupos A2 y A2B. cN-acetilgalactosaminiltransferasas en sueros del grupo A2 difieren en las propiedades cinéticas de las enzimas en sueros del grupo A1.

Sistema ABO Fenotipo A1 Fenotipo A2 A H

Expresión antigénica: Sistema ABO Expresión antigénica: Forma soluble (secretores) Saliva y todos los líquidos corporales, excepto el LCR Otras células sanguíneas Linfocitos, plaquetas (adsobidos del plasma). Tejidos En casi todas la cel epiteliales (epitelio glandular) y sobre células endoteliales. Amplia distribución en tejidos (Histo- sanguíneos)

Frecuencia de los grupos ABO en Cuba: Sistema ABO Los heterocigotos no se distinguen de los homocigotos: A1A1, A1A2 y A1O: todos reaccionan igual con Anti-A. Frecuencia de los grupos ABO en Cuba: Grupo % A A1 27,67 A2 8,26 variantes débiles 0,75 B 11,2 AB A1B 2,28 A2B 0,81 O 49,03 Becomo AA et al. Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 1997; 13(2): 124-131. 36,68 3,09

Características Generales de los Anticuerpos ABO: Sistema ABO Características Generales de los Anticuerpos ABO: Alta importancia clínica. Normalmente aparecen anticuerpos naturales en los individuos que no portan el antígeno en sus eritrocitos (evento único en la serología de los grupos sanguíneos). Se usan de forma habitual para la determinación de los grupos sanguíneos (grupo reverso). Son aglutininas frías usualmente clase IgM. Activan el Complemento. Causan hemólisis cuando son activos a 37 C (calientes).

Desarrollo con la edad: Sistema ABO Anticuerpos ABO: Desarrollo con la edad: En sangre de cordón umbilical Anti-A y Anti-B clase IgG de origen materno. Se detectan en lactantes entre 3-6 meses de nacidos (clase IgM). Mayor titulo se alcanza entre 5 y 10 años de edad.

Sistema Rh Se descubrió en 1940 por Weiner y Landsteiner. Después del ABO, el más importante en la clínica: Anti-Rh causa reacción transfusional hemolítica Incompatibilidad madre-hijo: enfermedad hemolítica del feto y del recien nacido. Se han descrito hasta 52 antígenos. Antígeno D: define condición de POSITIVO. Otros antígenos: C,c,E,e,d. Antígeno D: mosaico antigénico, determinado por epitopos.

Sistema Rh Cromosoma: 1p36.13-p34.3 Nombre de genes: RHD, RHCE Nombre del producto de los genes: polipéptido RhD, polipéptido RhCE. No. de exones: RHD 10, RHCE 10. Expresión: Eritrocitos de sangre de cordón. No formas solubles. Tejidos: Específicos de la línea eritroide.

Sistema Rh Anticuerpos vs. Rh(D): El polimorfismo del RhD es único. La mayoría de los que portan el gen D, tienen un polipéptido D completo. Pero existen variantes débiles, por expresión disminuída o incompleta. Anticuerpos vs. Rh(D): . Los aloanticuerpos anti-Rh(D) son inmunes por su origen (no naturales). Clase IgG, usualmente IgG1 y o IgG3. Pocas veces fijan Complemento Aparecen en individuos D negativos o en D parciales

Producción de reactivos hemoclasificadores basados en sueros humanos policlonales: Cada lote es una mezcla diferente de moléculas obtenidas de distintos donantes. Cada lote se comporta de forma diferente frente a las expresiones débiles del Ag. Hay diferente avidez. Pueden presentar poli aglutinación frente al antígeno críptico Tn. Se requiere obtener un policlonal anti A,B, para corroborar la reactividad del Anti-A y del Anti-B. Se requieren técnicas manuales bien realizadas.

Generación de hibridomas:

Ventajas de los Reactivos basados en AcM: Cada reactivo monoclonal es: Una aglutinina directa. Sólo una clase de Inmunoglobulina (IgM, IgA o IgG). De sólo una especificidad epitópica. De sólo una avidez No contiene Ac contaminantes.

Más simple en la etapa de producción a gran escala. Producción de los AcM: Altamente laboriosa e intensiva en la etapa de generación de hibridomas, clonajes y caracterización de las líneas célulares. Más simple en la etapa de producción a gran escala. Cada reactivo puede ser: Un único AcM Una mezcla de AcM Generalmente, los anti-A, anti-B y anti A,B son mezclas., para que funcionen mejor en los distintos métodos de hemaglutinación.

Especificaciones para garantizar la calidad de los reactivos hemoclasificadores basados en AcM: Establecer la concentración o titulo de AcM y condiciones de la solución amortiguadora (pH, conc. Salina). Clonaje celular por 3 veces, garantía de la monoclonalidad. Crear bancos de células semilla Maestros y de Trabajo. Cada lote se debe generar a partir de un criotubo del hibridoma congelado. Cultivar y expandir las células mediante pases seriados por no mas de 3 meses. Después de este tiempo: desechar los cultivos.

Errores que se deben evitar: AcM de alta afinidad: pueden detectar los fenómenos B(A) o A(B): cantidades muy pequeñas del antígeno contrario presentes normalmente en algunos individuos. Solución: diluir los AcM. Algunos AcM anti-B detectan el Ag B adquirido (no el B real sino una estructura estérica muy similar, que produce alta reacción). Se adquiere por infecciones de algunas bacterias, enfermedades reumáticas, etc. Solución: formular el reactivo en pH alcalino. Algunos AcM producen reacción en monocapa en tubos y microplacas. Solución: Tratar microplacas y tubos con Tween. Añadir albúmina o gelatina a la formulación en un bajo % (albúmina como máximo 3%, gelatina como máximo 1%). Mejor: albúmina 2-3%, gelatina 0.05%. Ayuda a la estabilidad del reactivo.

Problemas para la obtención del anti-D monoclonal: Mosaico D: Ag D es un mosaico de mas de 30 epítopos. Cada AcM detecta un solo epítopo. No todas las células D+ expresan todos los epítopos de D. Du= D “normal” pero con bajo numero de sitios en eritrocitos. Cada Anti-D monoclonal es diferente. Ningún AcM Anti-D detecta a todas las variantes, todos dejan algo. El problema es escoger al que detecta a los mas importantes epítopos para una correcta clasificación. Prueba de Anti-Globulina (Coombs): algunas variantes raras de D pueden dar FALSO POSITIVAS. En realidad no se deben transfundir con SANGRE Rh+, ya que D completo inmuniza.

Producción de AcM anti-D humanos: Ag D no es inmunogénico para ratones BALB/c: imposible obtener monoclonales murinos anti-D. Si se inmunizan humanos, se obtienen AcM clase IgG (poco aglutinantes): se debe seleccionar moléculas IgG3: molécula mas abierta mejor aglutinante. Producción de AcM anti-D humanos: Sangre de donantes inmunizados AcM Anti-D IgG - IgM Leucocitos + VEB Línea celular B transformada + / -fusión Clonajes

Reglas de Oro de la Calidad en reactivos hemoclasificadores: Nivel seguro en el titulo de anticuerpos. La especificidad, potencia, y avidez dependen de la concentración. Medición de la concentración de Ac por ELISA. Ej. Uso de conjugado anti-IgM o IgG de ratón. Garantía del pH final del producto: rango general 6.5-7.2. Se adiciona HEPES cuando se cosechan los sobrenadantes. Fortaleza iónica elevada, incrementa la actividad del reactivo.

ADITIVOS: EDTA: previene la lisis, especialmente en eritrocitos no lavados. También previene la degradación por proteolisis Gelatina: mejora la avidez, evita que los Ac formen monocapa con eritrocitos. Colorantes: Coloración intensa puede afectar resultados en microplacas.

Control de Calidad: Chequeo sistemático para demostrar que todo se hizo correctamente en la producción: Pruebas: Especificidad Reacción completa: 4+ Potencia: A o B 1/64 con fenotipos fuertes A1 o B Titulación con 2% de SAB 1/8-16 con fenotipos débiles: A2B o A1B para mantener la conc. de proteínas mientras se diluye. Avidez: según protocolo 5-10 segundos. Adicional: medir concentración de azida, conc. proteínas, pH y fuerza iónica.

Métodos de Producción: En animales de experimentación: Liquido ascítico murino (LAM). Ej. Anti-A, Anti-B. En biorreactores de fibra hueca: Todos, pero en particular el anti-D.(Mejores que los tanques agitados para la concentración de Ac). Chequear niveles de glucosa en el medio. Comenzar con SFB 5% y disminuir hasta 1% en el espacio extracapilar (las células y el SBF deben estar en el EE, mientras el medio se bombea al espacio intracapilar. La estabilidad de las líneas celulares mejora con los reclonajes. NUEVAS TECNOLOGIAS: Bibliotecas de fagos. Fragmentos de anticuerpos. Ingeniería de anticuerpos.

4to Congreso de la Sociedad Cubana de Hematología Nos vemos en Hematología Habana 2005!! Mayo 16-20, 2005 4to Congreso de la Sociedad Cubana de Hematología