ELECTROFORESIS Cuál de los siguientes enunciados es verdadero? La velocidad que adquiere una partícula que porta una determinada q es proporcional al E aplicado. La me de una proteína es directamente proporcional a la Mr e inversamente proporcional a la q. La FEO es proporcional al E aplicado en el sistema. En un fraccionamiento electroforético de proteínas de suero humano, el poder resolutivo del agar resulta mayor que el de una membrana de acetato de celulosa gelificado. La FEO es siempre indeseable en el desarrollo de las distintas técnicas electroforéticas. El desarrollo de calor es siempre indeseable en electroforesis. La movilidad de una partícula en electroforesis es directamente proporcional a la fuerza iónica del medio.

Rango de separación de fragmentos de DNA en geles de agarosa o poliacrilamida

ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA

ESTRUCTURA DE LA MATRIZ DEL GEL DE POLIACRILAMIDA Copolimerización de los monómeros de acrilamida y N,N’- metilenbisacrilamida

PAGE. POLIMERIZACION Reacción de catálisis por radicales libres: Iniciador: persulfato de amonio Catalizador o propagador de la reacción: TEMED (N,N, N’, N’-tetrametilendiamina (acelera la formación de radicales libres del iniciador) S2O82- + e-  SO42- + SO4-• (R•) R• + M  RM• RM• + M  RMM • , etc Iniciador: riboflavina + UV (reacción fotoquímica)  generación de R• TEMED no es imprescindible pero favorece la reacción

PAGE. POLIMERIZACION MONÓMEROS NEUROTÓXICOS!! Inhibición de la polimerización: oxígeno (bloqueo de R• iniciados por persulfato), pH ácido retarda la polimerización (presencia de ácido acrílico por hidrólisis) Luz y oxígeno: requeridos cuando se usa riboflavina Ajuste de la velocidad de polimerización (tiempo): cantidades óptimas de persulfato y TEMED Temperatura: óptima 25-30°C (a < 10°C: gel inhomogéneo, a 50°C: polímeros cortos)

PAGE: POROSIDAD DEL GEL T % y C % T = (Acrilamida + Bisacrilamida) % (p/v) C = Bisacrilamida / (Acrilamida + Bisacrilamida) % (p/p) T y C influyen sobre el grado de reticulación (tamaño de poro), resistencia mecánica, fragilidad y elasticidad del gel T < 4%: geles casi fluidos (agregar agarosa 0,5%) T > 25% ó C > 10%: geles opacos y quebradizos T (C 1%) Poro kDa 3 - 5 % 70 nm > 150 7 - 10 % 10 nm 40-100 15 - 20 % 5 nm < 10

Consideraciones prácticas Polimerización de los monómeros activada por la luz TEMED: sensible a la acción de la luz Evitar presencia de ácido acrílico (hidrólisis de acrilamida) Persulfato de amonio: hidratación del sólido e inestabilidad de las soluciones Conservar las soluciones en botellas oscuras a resguardo de la luz Agregar a la solución stock resina de intercambio aniónico (Amberlite IRA-400, Dowex1 ó 2) Preparar soluciones frescas. Conservar el persulfato sólido en desecador y las soluciones a -20°C

ELECTROFORESIS Efecto de la carga eléctrica y el tamaño molecular

GELES DE POLIACRILAMIDA VENTAJAS Tamiz molecular: tamaño de poro variable Químicamente inerte frente a moléculas biológicas Transparente, facilidad para ser densitometrado Estable en amplio intervalo de pH, fuerza iónica y temperatura Resistente a agentes desnaturalizante Fuerza electroendosmótica reducida Mecánicamente estable Fácil de almacenar Amplia versatilidad para la detección de compuestos analizados DESVENTAJAS Toxicidad de los monómeros El material no puede ser recuperado

PAGE CILINDRO (ROD) - PAGE VERTICAL PLACA (SLAB) - PAGE HORIZONTAL Tamaño variable. Siembra única. Dificultad para estandarizar. PAGE preparativa. Facilidad para PAGE en sistema multifásico de buffers. Equipo especial. PLACA (SLAB) - PAGE HORIZONTAL Espesor variable. Siembra múltiple y en distintas zonas del gel. Equipo común para otros sistemas electroforéticos. PLACA (SLAB) - PAGE VERTICAL Espesor variable. Siembra múltiple. Sentido único de electroforesis. Facilidad para PAGE en sistema multifásico de buffers. Equipo especial. Ventaja en estandarización del proceso.

PAGE SISTEMA HOMOGENEO DE GEL Y pH SISTEMA DE GEL DISCONTINUO Caso especial: gel con gradiente de poro SISTEMA MULTIFÁSICO DE BUFFERS (concentración de la muestra) CONDICIONES NATIVAS CONDICIONES DESNATURALIZANTES (ruptura de agregados, disociación en subunidades, solubilización). Posible alteración de actividad biológica, enzimática, inmunológica. Urea 6-8 M (agregada a muestra y gel): ruptura de puentes de H Detergentes no iónicos (Tritón X-100, Tween 20) o glicerol (70%) 2-mercaptoetanol o DTT (reducción de -S-S-): agregados a la muestra. No agregar al gel: inhibición de polimerización. Detergentes (aniónico SDS, catiónicos BCTA o CPC)

DETERMINACIÓN DE TAMAÑOS MOLECULARES. I.-DIAGRAMA DE FERGUSON log m = log m0 - KRT log Rf = log Y0 - KRT 1) PAGE de proteína X y 7 proteínas estándar en 5 geles con diferentes T% 2) Para cada proteína: gráfico de log Rf vs. %T 3) Para cada proteína, cálculo de KR (pendiente de la curva) 4) Gráfico de Mr (estándar) vs. KR 5) Mr de proteína X por interpolación del KR

PAGE - GRADIENTE DE PORO

DETERMINACIÓN DE TAMAÑOS MOLECULARES. II.-PAGE EN GRADIENTE DE PORO Gradiente adecuado a los componentes de la muestra: 4-16, 4-24, 4-30 Sistema multifásico de buffers Inclusión de marcadores de tamaño molecular (características similares a las de las proteínas en estudio) Curva de calibración: tamaño molecular vs. D recorrida o T alcanzada

DETERMINACIÓN DE TAMAÑOS MOLECULARES. III.- SDS-PAGE Combinación de la proteínas con SDS para enmascarar las cargas (tratamiento de la muestra) Agregado de SDS a la muestra y al buffer de los compartimientos electródicos Elección del T% del gel de separación de acuerdo con el tamaño de los compuestos a analizar Inclusión de marcadores de tamaño molecular (características similares a las de las proteínas en estudio) Electroforesis Curva de calibración: tamaño molecular vs. distancia recorrida

SDS- PAGE: curva de calibración y determinación de tamaños moleculares

SDS-PAGE EFECTO DE AGENTES DESNATURALIZANTES

GELES DE POLIACRILAMIDA APLICACIONES DETERMINACIÓN DE TAMAÑOS MOLECULARES ESTUDIOS DE HETEROGENEIDAD MOLECULAR (VARIANTES GENÉTICAS) INTERACCIONES (AGREGACIÓN, DISOCIACIÓN) INTERACCIONES (LIGANDO-RECEPTOR) IDENTIFICACIÓN (REACCIONES ANTÍGENO-ANTICUERPO) ESTRUCTURA (PROTEÍNAS OLIGOMÉRICAS, PUENTES DISULFUROS) MODIFICACIONES POTTRDUCCIONALES (GLICOSILACIÓN, FOSFORILACIÓN) ISOENZIMAS

Rango de separación de fragmentos de DNA en geles de agarosa o poliacrilamida