Libisch G 1, Casás M 1, Cayota A 2, Osinaga E 3, Robello C 1,4. 1 Unidad de Biología Molecular, 2 Laboratorio de Genómica Funcional, 3 Laboratorio de Glicobiología e Inmunología Tumoral, Instituto Pasteur de Montevideo. 4 Depto. de Bioquímica, Facultad de Medicina EVALUACIÓN DE LA O-GLICOSILTRANSFERASA ppGalNAc-T11 COMO MARCADOR MOLECULAR DE LEUCEMIA LINFOIDE CRÓNICA INTRODUCCIÓN La leucemia linfoide crónica B (B-LLC) es el tipo de leucemia más común entre las personas adultas de los países occidentales. Se caracteriza por una progresiva acumulación de linfocitos, que en el 95% de los casos corresponde a linfocitos B de tamaño pequeño, de aspecto maduro en sangre, médula ósea y tejidos linfoides, en estados tempranos del ciclo celular Dentro de las alteraciones moleculares más notorias de las células tumorales, se encuentra la alteración en el perfil de antígenos mucínicos de O- glicosilación debido a una elongación incompleta de estas cadenas. Las enzimas que participan en el primer paso de O-glicosilación son las enzimas ppGalNAc-Ts (polypeptide-N-acetil-α- galactosaminiltransferasas). Dado que existe evidencia importante de la alteración de la expresión de las ppGalNAc-Ts en diferentes tipos de cáncer, estas enzimas han sido de gran valor ya que se han utilizado como herramientas diagnósticas y/o pronósticas. La enzima ppGalNAc-T11 se plantea como una enzima importante, dado que su ortólogo en D.melanogaster es necesario para el desarrollo, pues los organismos knockout transgénicos que no la presentan no completan su desarrollo. Por otro lado existen fuertes indicios que la alteración de la expresión de una sola ppGalNAc-T podría estar involucrada en el proceso maligno. Este trabajo muestra el estudio de la ppGalNAc-T11 como marcador molecular en LLC. -Fuster, M. et al. The Sweet and Sour of Cancer: Glycans as novel Therapeutic Targets. Nature. 2005; Vol5: M. Hallek. Prognostic factors in chronic lymphocytic leukemia. Annals.of Oncology.2008; supplement4 : iv51-iv53. BIBLIOGRAFÍA RESULTADOS A partir de ARN de las líneas celulares Jurkat - línea de células T- y Daudi – línea de células B – se llevaron a cabo reacciones de RT-PCR, mediante las cuales se muestra una expresión diferencial de las diferentes ppGalNAc-Ts en cada tipo celular (Tabla 1) Tabla 1 Dado que se observan diferencias en la expresión de ppGalNAc-Ts entre células Jurkat y Daudi, se propone el análisis de la expresión de éstas en células B y T normales, además de analizar pacientes con LLC. (Tabla 2). Se observa la expresión de T11 en los 10 pacientes analizados y en células T, mientras no se observa su expresión en células B. Tabla 2 Se analizan 37 pacientes de LLC por real time PCR, de los cuales el 86.5 % presenta mayor expresión de T11 en comparación a un pool de células B de donantes sanos.(Fig.2) Dentro de los mismo un 59.5% presenta una relación de expresión de T11 en paciente LLC respecto a cel B mayor a 2, un 27% presenta dicha relación mayor a 1 y menor a 2, y un 13% presenta una relación menor a 1. Relación mayor a 2: 59..5%Relación mayor a 1 y menor a 2: 27% Relación menor a 1: 13% Fig 2 Con el fin de evaluar la expresión de T11 a nivel de proteína se realizaron western blots de extractos totales de proteínas de pacientes de LLC y de células B como control, (Fig 3) así como de las líneas celulares Jurkat y Daudi (Fig 4). Se observó la expresión de T11 en los pacientes con LLC, mientras no se observa en células B, y su expresión es menor en Daudi respecto a Jurkat. CelB Fig. 3 Anti-T11 Anti-Gapdh Anti-T11 Fig. 4 Finalmente se se clonó ppGalNAc-T11 en vector de expresión inducible por tetraciclina: pcDNA-4 del sistema T-REX de Invitrogen. Primero se transformó la línea Daudi con vector PcDNA-6 capaz de expresar el represor de tetraciclina, y luego dicha línea fue transformada con el vector pcDNA-4-T11. Se obtuvieron distintos clones de la línea Daudi pcDNA4-T11 capaces de expresar el represor de Tetraciclina (Fig6). De los msimos el clon D4 muestra por RT-PCR una sobreexpresión de T11 al ser inducido con tetraciclina (Fig 7) D4S D4C D4S D4C D4S D4C J T + CelB Bl ARN ARN J 1/200 J 1/500 J 1/1000 D 1/200 D 1/500 D 1/1000 JurkatDaudi D4S D4C E5S E5C G10 G10C J B M D4S D4C E5S E5C G10S G10C J B Fig. 6 Represor Tetraciclina GAPDH Fig. 7 CONCLUSIÓN y PERSPECTIVAS En base a los resultados obtenidos se muestra a la ppGalNAc-T11 como marcador de LLC aún no descrito. Se continuará con experimentos de Western blot con el fin de confirmar la sobreexpresión de ppGalNAc-T11 en la línea trasformada Daudi. Además se buscarán diferencias de expresión de distintos antígenos mucínicos de O-glicosilación al sobre expresar la proteína, y se realizarán experimentos de glicoproteómica con el objetivo de detectar sustratos de esta enzima. Este trabajo fu financiado por la Comisión Honoraria de Lucha Contra el Cáncer.