Virus del Papiloma Humano, Detección y Vacunas Dra. Marcela Lizano Soberón

Infección PERSISTENTE con VPH como causa necesaria para el desarrollo de CaCU Enfermedad de transmisión sexual Genoma del VPH 99% en Ca-CU Zur Hausen, 1977; Bosch, 2002; de Villiers, 2004.

Criterios para determinar papel viral en la carcinogénesis (zur Hausen 2001) Presencia regular y persistencia del respectivo DNA viral en biopsias tumorales y líneas celulares derivadas de dichos tumores. Demostración de promoción de crecimiento por genes virales específicos, en cultivos celulares o modelos animales disponibles. Demostración de que el fenotipo maligno depende de la expresión contínua de oncogenes virales. Evidencias epidemiológicas de la infección viral como factor de riesgo para el desarrollo del cáncer.

Cáncer Cérvico Uterino FACTORES HORMONALES VIDA SEXUAL STRESS OTROS HPV SISTEMA INMUNOLOGICO TABAQUISMO DESNUTRICION ALTERACION DE LA RESPUESTA INMUNE LOCAL FACTORES GENETICOS Cáncer Cérvico Uterino

Epidemiología del VPH VPH de alto riesgo en el 99% de los cánceres de cérvix . 15-43% prevalencia de VPH en mujeres con citololgía normal. ~70% de la mujeres estarán infectadas por VPH en algún momento de su vida. La mayor parte de estas infecciones serán transitorias. Koutsky et al. N Engl J Med 2002, 347:1645 Walboomers JM et al. 1999. J Pathol. 189:12. Orozco-Colín 2010. Int J Infect Dis. 14:1082. Kasan et al. 2011. Eur J Obster Gynecol Reprod Biol. Jul 14.

El virus del papiloma humano y el cáncer cérvico-uterino Menos del 2% de los individuos infectados Infección VPH persistencia NIC 2+ invasion Integración Tipo de VPH/ variantes intratipo Carga Viral Predisposición genética Respuesta inmune Normal

Incidencia de infecciones por HPV, precáncer y cáncer Lowy & Schiller. J Clin Invest. 116:1167, 2006

Relación evolutiva entre VPHs Relación evolutiva entre VPHs J. Doorbar et al. / Vaccine 30S (2012) F55– F70

Papilomavirus Alpha y asociación con enfermedad Doorbar J et al. / Vaccine 30S (2012) F55– F70

Genoma del VPH Región Larga de control Oncogenes Replicación Proteínas de la cápside Replicación y transcripción

Efecto de Integración del DNA viral al genoma hospedero X X    

Ciclo de vida de VPH en el epitelio cervical

Woodman CBJ et al.,Nat Rev 2007; 7:11.

Patogénesis del cáncer de cérvix zur Hausen

Información relevante de VPH y CaCU La infección por VPH es muy común El CaCU siempre es causado por el VPH Tener VPH no significa que la mujer desarrollará CaCU. Más del 90% de las infecciones detectadas se eliminan en los siguientes 2 años. La infección con VPH de alto riesgo que persiste por más de 4 años aumenta el riesgo al cáncer por 100x

Los VPH se detectan prácticamente en todos los casos de CaCU y en una proporción de sus lesiones precursoras. La infección por VPH es la CAUSA NECESARIA del cáncer de cérvix, pero NO SUFICIENTE. Una vacuna totalmente eficaz contra VPH16 y 18 eliminaría cerca del 70% de los cánceres de cérvix.

La estrategia completa para eliminar el cáncer involucra la detección temprana, el tratamiento y la prevención

Prevención Primaria Vacunación Intento prometedor para reducir incidencia y mortalidad de CaCU Secundaria Detección oportuna del cáncer El primer factor en el pronóstico es la detección en etapas tempranas de la enfermedad: - Pap - Colposcopía - Detección de ADN de VPH de alto riesgo Tratamiento oportuno de lesiones premalignas

Diagnóstico molecular de VPH Los modelos de cultivo in vitro son poco eficaces y costosos. Los anticuerpos carecen de valor diagnóstico. La detección de DNA de VPH aporta una excelente sensibilidad que debe ser valorada cuidadosamente debido a la ubicuidad del virus. Las mujeres infectadas con VPH-AR se encuentran en mayor riesgo de desarrollar CaCU que las infectadas con tipos de VPH de bajo riesgo. Manejo menos agresivo en mujeres VPH neg con anormalidades citológicas leves o equívocas, dado que es poco factible que progresen. La incorporación de pruebas de detección de VPH en los programas de tamizaje puede ayudar a identificar a mujeres en riesgo a desarrollar CaCu.

Mayor sensibilidad de detección de LIE de alto grado 76.2% 89.2% 96.9% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Pap Prueba VPH Pap + VPH Sensibilidad The results are interesting: As you can see, the sensitivity of the HPV test was superior to that of the Pap test. The HPV test had a sensitivity of 89.2% for detection of HSIL versus the Pap’s sensitivity of 76.2%. Researchers estimated “that an HPV based algorithm including the immediate colposcopy of HPV-positive women, and then repeat Pap testing of all others, would provide an overall sensitivity of 96.9%”.10 Furthermore, the HPV test identified 100% of all women with HSIL who had an AGUS smear, whereas repeat Pap smears identified only 57% of HSIL in women who had an AGUS smear. Employing reflex HPV testing, the referral to colposcopy was reduced to 38%, representing a 62% reduction compared to colposcoping all women with ASCUS. The specificity of the repeat Pap smear was about the same as the specificity of the HPV test. With superior sensitivity and comparable specificity, clearly HPV testing is the better option. Should you wish to review the Kaiser study in its entirety, the data was published in the Journal of the American Medical Association in April 1999. Participantes: 995mujeres con ASCUS Manos, M.M., et al., Identifying Women With Cervical Neoplasia. JAMA, May 5, 1999

Sensibilidad de distintas técnicas de detección de VPH Hibridación in situ Southern blot PCR en tiempo real Sonda directa Señal amplificada

Toma de muestra para la detección de VPH La toma de muestra se obtiene de la región exo- endocervical con cepillos especiales. Se transporta al laboratorio en medio líquido (la muestra puede ser viable dos semanas a temperatura ambiente aunque es conveniente refrigerarla). Puede utilizarse el mismo medio empleado en la citología líquida. Los estudios de toma por el propio paciente han demostrado su eficacia.

HC2 Límite de detección: 4000–5000 HPV copies Denature nucleic acids RNA:DNA complex antibodies Hybridize target DNA with RNA probe Chemiluminescent signal amplification Capture RNA:DNA hybrids onto microtiter plate Reagent reversal modification

Tipos de VPH identificados en HC2 La prueba de captura híbrida utiliza dos mezclas de sondas de RNA para diferenciar entre tipos de VPH oncogenicos y de bajo riesgo Bajo riesgo 6, 11, 42, 43, 44 Alto riesgo 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 The Hybrid Capture® 2 test is designed to detect 5 low risk and 13 high risk HPV types, including the most prevalent carcinogenic types, 16 and 18. For each specimen tested, the results generated will inform the physician if the patient is positive for a high risk HPV type, a low risk HPV type, both high and low risk HPV types, or if the patient is negative. The test does not identify the specific type of HPV that is present, but rather distinguishes between a high or low risk infection. All high risk patients will follow the same patient management protocol, regardless of the high risk type that is present.

La amplificación de la secuencia blanco es exponencial PCR La amplificación de la secuencia blanco es exponencial La amplificación del blanco es exponencial

PCR / PRIMERS CONSENSO SOBRE EL GEN L1 5’ 3’ MY11/09 450 pb 150 pb GP5/6+ 65 pb SPF1/2 65 pb L1C1/2 Secuenciación de Productos de PCR Blast

Métodos de genotipificación por PCR No todos los sistemas de tipificación brindan los mismos resultados... - La estandarización es crítica Cada sistema de primers bien validado sufre de problemas de sensibilidad para algunos tipos virales. MY09/11: 26, 35, 45, 52, 55, 59, 68, 73, 83 PGMY09/11: 31, 52 GP5+/6+: 53, 61 SPF10: 42, 56, 59

Detección de infecciones múltiples LBA (Roche) Reference line High beta-globin Low beta-globin Note: Research array depicted. The commercial array will have differences in probe composition and configuration from research prototype

E6 Nested Multiplex PCR PRIMERS GENERALES (602-666 pb) E6-E7 (602-666 pb) 16 16 18 45 45 18 31 PRIMERS ESPECÍFICOS COCKTAIL 1 16,18,31,59,45 (151-457 pb) COCKTAIL 3 35,42,43,44 (163-358 pb) COCKTAIL 4 68,39,51,66 (172-333pb) COCKTAIL 2 33,6/11,58,52,56 (181-398 pb) Sotlar K. et al. J.Clin.Microbiol. 2004. 42:3176-84.

Recomendaciones para el manejo del paciente con criterio de positividad a VPH HPV + HPV - PAP anual o trianual de rutina colposcopía PAP normal ASCUS  LIEBG Massad LS et al. J Low Genit Tract Dis. 2013 17:S1-S27. Guías clínicas ASCCP 2006

Detección de VPH en mujeres > 30 años Tamizaje con VPH y PAP Si cualquiera de las pruebas es positiva, seguir la estrategia normal del flujograma de ascus y continuar con el tamizaje anual. Si ambas pruebas son negativas, extender el intervalo de tamizaje hasta 3 años. Massad LS et al. J Low Genit Tract Dis. 2013 17:S1-S27. Guías clínicas ASCCP 2006.

Prueba de DNA de VPH: Se requiere genotipificar?

Tipificación de VPH Tipo: > 10% diferencias en genoma Subtipo: Diferencias del 10 a 2 % Variante: < 2 % en secuencias codificantes (E6,E7,L1) < 5% en secuencias no codificantes (LCR) 160 tipos de VPH se han clasificado de acuerdo a su nicho ecológico, potencial oncogénico y posición filogenética Burk RD, et al. Virology 2013;445:232–43.

Usos potenciales Investigación Prueba de curación Definir persistencia para manejo de citología normal en mujeres VPH positivas Vigilancia en poblaciones vacunadas

Investigación La ausencia de tipificación en estudios epidemiológicos asume igualdad en el espectro de genotipos de VPH: Ya demostrado que hay diferencias en potencial oncogénico. Entre los tipos oncogénicos – existen diferentes riesgos de progresión o persistencia?

. . . . . .. . . .. . . .. . . Carrillo García A, et al. Gynecol Oncol 2014; 134-534-539.

Carrillo García A, et al. Gynecol Oncol 2014; 134-534-539.

ASOCIACION ENTRE TIPO DE MUESTRA (CA+LIEAG VS LIEBG) Y COMBINACION DE VPH ENTRE TODAS LAS MUESTRAS POSITIVAS Carrillo García A, et al. Gynecol Oncol 2014; 134-534-539.

Prueba de curación Confirmación de que la lesión asociada a la infección por VPH ha sido erradicada por terapia excisional, vacuna profiláctica, quimioterapia (enfermedad residual).

Vigilancia en poblaciones vacunadas Genotipificación en programas de tamizaje seleccionados pre- y post- vacunación. Monitoreo del decremento temporal anticipado en la prevalencia de VPH16/18 Monitoreo en el incremento potencial de otros genotipos virales. Evaluación de la protección cruzada potencial de la vacuna. La genotipificación de VPH facilitará la investigación epidemiológica de la historia natural de las infecciones por VPH,Tanto pre- como post-vacunación. La genotipificación de VPH puede ser clínicamente valiosa en el seguimiento de pacientes tratados y pacientes en riesgo por resultar VPH+ en las pruebas de tamizaje

Expresión de VPH en la progresión neoplásica

Detección de mRNA de VPH El VPH que se está transcribiendo (producción de mRNA viral) asegura que la infección es activa. En particular, la expresión abundante de mRNA de E6 y E7 habla de una infección con alto riesgo de transformación. Vs la detección de DNA, tiene un mayor valor predictivo positivo.

Comparación entre diferentes métodos comerciales de detección de VPH Método Paciente Principio Detecta persistencia Muestra infec. activa Evita seg. innecesario Detecta DNA/mRNA Genotip. VPH CH2 No No No DNA No LBA Sí No No DNA Si PreTect HPV-proofer Sí Sí Sí mRNA Sí

Debido a la sensibilidad de las pruebas moleculares la detección de DNA de VPH no necesariamente va acompañado del desarrollo de un proceso tumoral, por lo que otros pruebas podrían requerirse: Citología Genotipificación Expresión de mRNA de VPH Integración de DNA viral Estatus de p16 y otros marcadores celulares Carga viral de VPH

Vacunas vs. VPH

Los Papilomavirus codifican 2 proteinas estructurales Dos proteinas estructurales: L1: Cada partícula tiene 360 copias. L2: Cada partícula tiene 12 copias. La proteina L1 se autoensambla de forma tridimensional formando “viriones” vacíos denominados “virus-like particles (VLPs)” Doug Lowy (NCI, USA)

Vacunas profilácticas vs VPH Vector de Expresión o baculovirus L2 L1 L1 L2 VLPs L2 (Virus-Like particles) Expresión y ensamblaje de L1 y L2 en células de levadura o de insecto

VLPs (Virus Like Particles)

Partículas virales VLP No contienen DNA viral Inducen anticuerpos neutralizantes contra tipos específicos. Tienen efecto protector en conejos y perros, cuando se administran previamente al reto con papilomavirus de conejo y oral canino. Breitburd et al. 1995 J Virol 69:3959. Suzich et al. 1995 PNAS 92:11553.

específicas para diferentes tipos de VPH (VLPs) específicas para diferentes tipos de VPH Vacunación con HPV-L1-VLPs DNA que codifica VPH-L1 Inducción de anticuerpos neutralizantes Auto-ensamblaje de VLPs Proteína L1 VPH de alto riesgo Transferencia génica y expresión en modelo de levadura Purificación J. Clin. Invest. 2004; 114 (4):450–462

Desarrollo de vacuna contra VPH Más de 25 años... 2006 Registro 2002 Estudios fase III - tetravalente 2002 Estudios fase II – monovalente y tetravalente 2001 Estudios fase I - monovalente 1997 Estudios Pre-clínicos: VLP induce respuesta de Ig neutralizante 1995 Agencia Internacional de Investigación en Cáncer declara a VPH tipos 16 y 18 como carcinógenos VPH involucrado en transformación celular maligna 1991 Partículas similares a virus (VLP) ensambladas en levadura y células de insecto 1990s Primeros intentos DNA desnudo - vaccinia virus - proteínas de fusión Autoensamblaje de proteinas de cápside L1 y L2 1980s Sospecha Correlación VPH – CACU Annu Rev Med 2004;55:319-31 N Engl J Med 2002 ;347(21):1703-1705

Eficacia de la Vacuna Cuadrivalente VPH 6,11,16 y 18 FUTURE II – Resultados N Engl J Med 2007;356:1915-27 Análisis Punto Final Vacuna VPH Placebo Eficacia (95% IC) # de Mujeres # de Casos (Tasa**) # de Casos (Tasa PP NIC 2/3, AIS* y Cáncer Relacionado a VPH-16 y 18 5,305 1 (<0.1) 5,260 42 (0.3) 98 % IT 6,087 83 (0.5) 6,080 148 (0.8) 44 % NIC 2/3, AIS* y Cáncer Relacionado a cualquier tipo de VPH 219 (1.3) 266 1.5 17%

Transudación o exudación de anticuerpos séricos al sitio de la infección por VPH Schwarz TF, Oberdan L. Gynecol Oncol. 2008; 110:S1-S8

Títulos de anticuerpos anti-VPH18 inducidos por las vacunas Las pruebas clínicas muestran que la protección continúa. Se desconoce cuales son los niveles mínimos de anticuerpos anti-VPH 16 y 18 para proteger contra la enf. clínica Harper D. Prophylactic HPV vaccines: Current knowledge of impact on gynecologic premalignancies. Discovery Medicine July 2010.

Desarrollo de NICs I AIS relacionados con HP6,11,16,18 en población vacunada (Gardasil) Posible generacion de Celulas B de memoria Joura EA, et al.Vaccine 2008, 26:6844

Incidencia de Ca de cérvix Modelo de estimación del impacto clínico de la vacuna profiláctica HPV-16/18 Sin Vacunación 120 50% 100 75% VACUNACION 98% 80 Incidencia de Ca de cérvix Por 100,000 mujeres 60 40 20 54 14 18 22 26 30 34 38 42 46 58 62 66 50 EDAD (AÑOS) Goldie S et al. 2003 Int J Cancer 106:893.

Tipos de VPH: 16, 18, 31, 33 ,45, 52,58 6, 11