DIAGNÓSTICO GENÉTICO PREIMPLANTATORIO Dra. Dolores Lozano Arana LABORATORIO DE FIV UNIDAD CLÍNICA DE GENÉTICA Y REPRODUCCIÓN HOSPITALES UNIVERSITARIOS VIRGEN DEL ROCÍO SEVILLA

1990 (Handyside et al) primer embarazo tras PGD. Diagnóstico Genético Preimplantatorio Definición Definición Análisis genético de los preembriones obtenidos por técnicas de fecundación in vitro antes de ser transferidos al útero. 1990 (Handyside et al) primer embarazo tras PGD. Consorcio para PGD (ESHRE)

Ofrecer una opción reproductiva a familias Diagnóstico Genético Preimplantatorio Objetivo Objetivo Ofrecer una opción reproductiva a familias con alto riesgo de transmitir enfermedades de base genética a su descendencia.

Historial reproductivo particular: - Hijo afecto Diagnóstico Genético Preimplantatorio Objetivo Parejas Historial reproductivo particular: - Hijo afecto - IVE - Conocimiento exhaustivo de su patología Opciones: - No tener hijos biológicos/Adoptar/Donación gametos - Diagnóstico prenatal - PGD

PGD vs Diagnóstico Prenatal Diagnóstico Genético Preimplantatorio Objetivo PGD vs Diagnóstico Prenatal

Tipos PGD de alto riesgo. PGD de bajo riesgo. Diagnóstico Genético Preimplantatorio Tipos Tipos PGD de alto riesgo. PGD de bajo riesgo.

Diagnóstico Genético Preimplantatorio Tipos PGD de alto riesgo Parejas con elevado riesgo de transmitir anomalías cromosómicas o genéticas a sus hijos.

PGD alto riesgo Autosómicas recesivas Autosómicas dominantes Diagnóstico Genético Preimplantatorio Patologías PGD alto riesgo Autosómicas recesivas Fibrosis quística Atrofia muscular espinal Ligadas a X Hemofilias DM Duchenne Autosómicas dominantes Corea de Huntington Distrofia miotónica Anomalías cromosómicas estructurales

Edad avanzada (>37 años) Fallos repetidos de implantación tras FIV Diagnóstico Genético Preimplantatorio Tipos PGD bajo RIESGO (PGS ó PGD-AS) Parejas infértiles en tratamiento de FIV para mejorar tasas de gestación. Edad avanzada (>37 años) Fallos repetidos de implantación tras FIV Parejas con cariotipo normal con abortos de repetición

PGD bajo riesgo (PGS ó PGD-AS) Diagnóstico Genético Preimplantatorio Patologías PGD bajo riesgo (PGS ó PGD-AS) Screening de aneuploidias: Alteración en el número de cromosomas Diagnóstico por FISH Sondas más frecuentes: 13 (Trisomía - Sd. Patau) 18 (Trisomía - Sd. Edwards) 21 (Trisomía - Sd. Down) X, Y (X0, XXY,...) Otros: 22, 16, 15

Diagnóstico Genético Preimplantatorio

Diagnóstico Genético Preimplantatorio Tipos PGD de alto riesgo Parejas con elevado riesgo de transmitir anomalías cromosómicas o genéticas a sus hijos.

Genética Programa PGD FIV Diagnóstico Genético Preimplantatorio Organización Consejo genético Análisis previos FIV Genética Programa PGD Biopsia FIV Fijación DP Transf PCR FISH

Obtención de embriones Biopsia embrionaria Diagnóstico Genético Preimplantatorio Método Fase previa Obtención de embriones Biopsia embrionaria Análisis genético diagnóstico Transferencia embrionaria

Obtención de embriones Biopsia embrionaria Diagnóstico Genético Preimplantatorio Método Fase previa Obtención de embriones Biopsia embrionaria Análisis genético diagnóstico Transferencia embrionaria

FASE PREVIA: CONSULTA CONJUNTA DE GENÉTICA CLÍNICA Y REPRODUCCIÓN Diagnóstico Genético Preimplantatorio Método FASE PREVIA: CONSULTA CONJUNTA DE GENÉTICA CLÍNICA Y REPRODUCCIÓN - Consejo Genético - Análisis genéticos previos - Consulta pre-FIV - Criterios de Inclusión/exclusión: El diagnóstico es técnicamente posible y fiable Riesgo de recurrencia EBG que genere graves problemas de salud Edad materna*, FSH basal* No contraindicaciones para FIV - Consentimientos informados de PGD y FIV

Obtención de embriones Biopsia embrionaria Diagnóstico Genético Preimplantatorio Método Fase previa Obtención de embriones Biopsia embrionaria Análisis genético diagnóstico Transferencia embrionaria

Obtención de embriones: Tratamiento de FIV Diagnóstico Genético Preimplantatorio Método Obtención de embriones: Tratamiento de FIV - Estimulación ovárica controlada. - Controles clínicos y ecográficos. - Punción folicular bajo anestesia. - Obtención de ovocitos. - Fecundación de los ovocitos.

Tratamiento de FIV Consideraciones especiales: Diagnóstico Genético Preimplantatorio Método Tratamiento de FIV Consideraciones especiales: - Mejor respuesta mayor número de ovocitos 12 ovocitos (M II) 10 fecundados  1 sin resultados  4 afectos  1 bloqueado - ICSI SHO

Diagnóstico Genético Preimplantatorio Método Día 0

Diagnóstico Genético Preimplantatorio Método Día 0

Diagnóstico Genético Preimplantatorio Método Día 0

Diagnóstico Genético Preimplantatorio Método Día + 1

Diagnóstico Genético Preimplantatorio Método Día + 2

Obtención de embriones Biopsia embrionaria Diagnóstico Genético Preimplantatorio Método Fase previa Obtención de embriones Biopsia embrionaria Análisis genético diagnóstico Transferencia embrionaria

Biopsia embrionaria Tipos: - Corpúsculo polar información materna Diagnóstico Genético Preimplantatorio Método Biopsia embrionaria Tipos: - Corpúsculo polar información materna - Blastómeras Habitual - Blastocisto Más células Poco tiempo Mosaicismos

Biopsia embrionaria – blastómeras Diagnóstico Genético Preimplantatorio Método Biopsia embrionaria – blastómeras - Día + 3 (6-8 blastómeras) - Totipotenciales - Inicio de compactación - Uniones calcio dependientes Técnica: - Medio libre de calcio y magnesio - Mecánico, Acido Tyrode, Láser* - Extracción de 1 ó 2 blastómeras - Mononucleadas Ca++ Ca++ Ca++

Biopsia embrionaria – blastómeras Diagnóstico Genético Preimplantatorio Método Biopsia embrionaria – blastómeras - Día + 3 (6-8 blastómeras) - Totipotenciales - Inicio de compactación - Uniones calcio dependientes Técnica: - Medio libre de calcio y magnesio - Mecánico, Acido Tyrode, Láser* - Extracción de 1 ó 2 blastómeras - Mononucleadas

Obtención de embriones Biopsia embrionaria Diagnóstico Genético Preimplantatorio Método Fase previa Obtención de embriones Biopsia embrionaria Análisis genético diagnóstico Transferencia embrionaria

Diagnóstico genético Técnica: Fijación de núcleos Lisis celular Diagnóstico Genético Preimplantatorio Método Diagnóstico genético FISH PCR (Hibridación in situ fluorescente) (Reacción en cadena de la polimerasa) Técnica: Fijación de núcleos Lisis celular Hibridación Amplificación Diagnóstico: Aneuploidias Mutaciones Selección de sexo Translocaciones

FISH - Hibridación Diagnóstico Genético Preimplantatorio Método G T A DNA cromosómico A T C G desnaturalización de sonda y cromosomas G T A C sonda Cromosoma en el porta

FISH - Hibridación Diagnóstico Genético Preimplantatorio Método A T A Hibridación de sonda y cromosomas Visualización de la señal fluorescente A C G T

- Número limitado de sondas por ronda - Fallo de hibridación Diagnóstico Genético Preimplantatorio Método Problemas de FISH - Número limitado de sondas por ronda - Fallo de hibridación - Overlaps - Número limitado de sondas disponibles - Mosaicismos

Diagnóstico genético Técnica: Fijación de núcleos Lisis celular Diagnóstico Genético Preimplantatorio Método Diagnóstico genético FISH PCR (Hibridación in situ fluorescente) (Reacción en cadena de la polimerasa) Técnica: Fijación de núcleos Lisis celular Hibridación Amplificación Diagnóstico: Aneuploidias Mutaciones Selección de sexo Translocaciones

Diagnóstico Genético Preimplantatorio Método PCR

Diagnóstico Genético Preimplantatorio Método PCR Cystic Fibrosis DF 508 Positive control (carrier) Molecular weight marker Affected embryo (first cell) Affected embryo (second cell) Heterozygote embryo (first cell) Heterozygote embryo (second cell) No diagnosis because of ADO in the second cell of the embryo FIGO-IFSS, Barcelona 2004

Problemas de PCR de PCR de célula única. Posibles causas: Diagnóstico Genético Preimplantatorio Método Problemas de PCR - Los fallos de amplificación ocurren en el 5-10% de PCR de célula única. Posibles causas: - pérdida de la célula - célula sin núcleo o degenerado - fallos en la lisis celular - Alelle Dropout (amplificación de un alelo) - Contaminación (espermatozoides, células de granulosa…) - Mosaicismos

Obtención de embriones Biopsia embrionaria Diagnóstico Genético Preimplantatorio Método Fase previa Obtención de embriones Biopsia embrionaria Análisis genético diagnóstico Transferencia embrionaria

DIAGNÓSTICO GENÉTICO PREIMPLANTATORIO Blastocisto FISH Verde - Cromosoma X Acqua - Cromosoma 18 Día +4 Fijación Biopsia d +3 núcleo núcleo citoplasma Verde – Cromosoma 13 Rojo – Cromosoma 21

Tasa de gestación 15-20% por ciclo iniciado Diagnóstico Genético Preimplantatorio Resultados Tasa de gestación 15-20% por ciclo iniciado Fiabilidad 95% Se recomienda Diagnóstico Prenatal a todas las gestantes

Consideraciones especiales del PGD Diagnóstico Genético Preimplantatorio Consideraciones especiales Consideraciones especiales del PGD - Consejo Genético - Parejas sin esterilidad - Necesidad de mejor respuesta ovárica - Mayor riesgo SHO - ICSI - Diagnóstico prenatal recomendable - Evaluación y seguimiento RN recomendable

Limitaciones del PGD - Las pacientes tienen que someterse a un Diagnóstico Genético Preimplantatorio Limitaciones Limitaciones del PGD - Las pacientes tienen que someterse a un ciclo de FIV - Alta tasa de cancelaciones - Todos los embriones pueden ser afectos - Viabilidad del embrión - Posibles errores de diagnóstico

Diagnóstico Genético Preimplantatorio Sistema Sanitario Público de Andalucía DECRETO 156/2005 de 28 de junio, por el que se regula el Diagnóstico Genético Preimplantatorio en el Sistema Sanitario Público de Andalucía y se crea la Comisión Andaluza de Genética y Reproducción.

Enfermedades genéticas ligadas al sexo: Enf. Duncan DMD Hemofilia B Diagnóstico Genético Preimplantatorio Sistema Sanitario Público de Andalucía Enfermedades genéticas ligadas al sexo: Enf. Duncan DMD Hemofilia B Hemofilia A Sind. Pellizaeus Merzbacher Sind. Alport

RESULTADOS DE LABORATORIO Diagnóstico Genético Preimplantatorio Sistema Sanitario Público de Andalucía RESULTADOS DE LABORATORIO Nº CICLOS: 13 TRANSFERENCIAS: 8 MEDIA/ciclo EDAD DE LAS PACIENTES 30.3 OVOCITOS MADUROS 9.7 OVOCITOS FECUNDADOS 7.3 74.8 % EMBRIONES BIOPSIADOS 5 69.4 % EMBRIONES INFORMATIVOS 4.4 87.8 % EMBRIONES TRANSFERIDOS 1.5* TASA TRANSFERENCIA 61.5 % TASA GEST. CLIN ./TRANSFER 25 % *media de embriones transferidos en las 8 transferencias realizadas

Genetistas Salud Borrego López Irene Marcos Luque Ana Peciña López Raquel Fernández García Javier Sánchez García Embriólogas M. Dolores Lozano Arana Beatriz Sánchez Andújar Ginecólogos Juan Carlos García Lozano José Luis García Benítez Antonio Jiménez Díaz de la Serna Manuel Ledesma Mestre Juan Luis Moliní Rivera Enrique Moreno Pacha Director Guillermo Antiñolo