DETERMINACION DE METABOLITOS Diagnóstico bioquímico – clínico Seguimiento de una reacción enzimática por detección de metabolitos secundarios Agosto 10, 2006

METABOLITOS A DETERMINAR: GLUCOSA COLESTEROL HDL / LDL TRIGLICERIDOS UREA

DETERMINACIÒN DE GLUCOSA POR PRUEBA ENZIMÀTICA D-glucosa + O2 ácido D- glucónico + H2O2 Glucosa Oxidasa H2O2 + p-HBA + 4-AAP compuesto coloreado+ H2O peroxidasa

Prueba de Tolerancia a la Glucosa Se puede evaluar la eficiencia del metabolismo de glucosa cuantificando los niveles de glucosa en sangre luego de una carga de glucosa oral. La tolerancia a la glucosa implica que luego de esta carga no se observe glucosa en la orina (glucosuria) y que la glucosa en sangre siga una curva típica a la largo del tiempo (ver figura).

Las condiciones clínicas que pueden estar asociadas con un resultado anormal de tolerancia a la glucosa (fuera de la diabetes) son las siguientes: Ingestión de carbohidratos disminuida en los días anteriores a la prueba Insuficiencia hepática severa Enfermedades crónicas con desnutrición (alcoholismo, uremia) Inactividad física prolongada (más de 72 horas en cama) Stress agudo (fiebre, trauma, cirugía mayor) Enfermedades endocrinas (acromegalia, síndrome de Cushing, insulinoma, glucagonoma entre otras) Uso de drogas Sobrepeso (más de 20% sobre el peso ideal) Trastornos gastrointestinales

TOLERANCIA A LA GLUCOSA   Blanco Estandar M 1 M 2 M 3 M 4 M 5 Tiempo luego de ingesta de glucosa Basal 30 min 60 min 90 min 120min Muestra 0.01mL Estándar Glucosa Solución (G) 1mL

1.    Incubar a 37°C por 5 minutos o 10 minutos a Temperatura ambiente. 2.    Leer absorbancia de las muestras a 505nm dentro de los primeros 30 minutos 3.    Calcular la concentración de la glucosa en las muestras proporcionadas, según la siguiente fórmula: Concentración de Glucosa: Amuestra x Cestándar / Aestándar   4.    Graficar la curva de tolerancia de glucosa con los datos obtenidos 5.    Determinar el diagnóstico del paciente de la muestra según el grafico de la curva de tolerancia a la glucosa 6.    Discutir los resultados DATO: El intervalo de referencia normal en suero es 70 mg/dL – 100 mg/dL

Figura No.1 Estructura de una lipoproteína

Colesterol ester Colesterol + Acidos grasos Hidrolasa Colesterol + O2 colesterol-4-en-3-ona + H2O2 Colesterol oxidasa 2 H2O2 + 4-AAP + p-HBA compuesto coloreado + 4H2O peroxidasa

Concentración de colesterol: Amuestra x Cestándar / Aestándar Determinación de Colesterol Total El método para determinar el Colesterol Total consta de 3 reacciones acopladas: La enzima Colesterol Ester Hidrolasa, libera el colesterol de los esteres de colesterol EL colesterol liberado es oxidado por la Colesterol Oxidasa produciéndose péroxido de hidrógeno El peroxido de hidrogeno, en presencia de la enzima Peroxidasa reacciona con el sistema cromogénico dando origen a un compuesto coloreado, que es leido en el espectofotómetro a 505nm. Concentración de colesterol: Amuestra x Cestándar / Aestándar

Determinación de LDL-Colesterol EL LDL-Colesterol (colesterol asociado a las lipoproteínas de baja densidad, LDL) es obtenido por precipitación selectiva del LDL mediante el uso de una solución de Heparina y Citrato de Sodio, quedando el colesterol asociado al HDL y VLDL en el sobrenadante. Por lo tanto la concentración de LDL-Colesterol precipitado se calcula obteniendo el diferencial entre el valor de Colesterol Total y el valor obtenido en el sobrenadante, el cual corresponde al Colesterol asociado a HDL y VLDL. Calcular la concentración del colesterol en el sobrenadante: Abs muestra x factor Factor = 240 . Absorb. Standard Calcular la concentración del LDL colesterol, según la siguiente fórmula: LDL colesterol (mg/dL) = Colesterol total - Colesterol en Sobrenadante

Determinación de Triglicéridos Triglicéridos Glicerol + Acidos grasos Lipasa Glicerol + ATP Glicerol-1-fosfato + ADP Glicerol kinasa Glicerol 1-fosfato + O2 Dihidroxiacetonafosfato + H2O2 Glicerol-fosfato Oxidasa 2 H2O2 + 4-AAP + DCBS compuesto coloreado + 4H2O peroxidasa

Determinación de Urea CONH2CO + 2 H2O 2 NH3 + CO2 + H2O Ureasa

DETECCIÓN DE AMONIO EN LA REACCIÓN DE HIDRÓLISIS DE LA PIRAZINAMIDA (PZA), POR MEDIO DE LA PRUEBA DE NESSLER. La hidrólisis de la Pirazinamida (PZA) por acción de la Pirazinamidasa puede ser observada/monitorizada de modo indirecto mediante la detección de amoniaco (NH3), un metabolito secundario de esta reacción. El amoniaco producido reacciona con el reactivo de Nessler, una solución alcalina de mercuri-yoduro de Potasio, K2HgI4, formando un precipitado de color pardo o amarillo. La fórmula de dicho precipitado no está bien definida, ha sido descrita como O:Hg2N.NH2.I por (Arthur I. Vogel, 1974), o también como NH2.Hg2.I3 (Nichols y Willits, 1934).

DETECCIÓN DE AMONIO EN LA REACCIÓN DE HIDRÓLISIS DE LA PIRAZINAMIDA (PZA), POR MEDIO DE LA PRUEBA DE NESSLER. Pirazinamida (PZA) 1 Acido Pirazinoico (POA) + 1 Amoniaco(NH3) 1 NH3 + [K2HgI4] + 8 KOH O:Hg2.NH2.I + 7 KI + 2 H20