INMUNOCITOQUÍMICA fijación con metanol TRANSFECCIÓN ANALISIS POR CÉLULAS EN MONOCAPA TRANSFECCIÓN FIJACIÓN (paraformaldehído o gluteraldehido) fijación con metanol (fija y permeabiliza a la vez) PERMEABILIZACIÓN BLOQUEO ANALISIS POR MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIA LAVADOS ANTICUERPO PRIMARIO ANTICUERPO SECUNDARIO

Manipulación de células en cultivo: 1) MEDIO DE CULTIVO Requerimientos Aporte Composición *glucosa (fuente de C) *aminoácidos (fuente de N) *cofactores enzimáticos *vitaminas *sales Nutrientes MEDIO DE CULTIVO *Transferrina *Albumina, *Factores de crec. *Factores de anclaje Estimulo proliferativo y adhesivo SUERO *penicilina *estreptomicina *gentamicina ANTIBIOTICO Prevención de contaminaciones *hormonas *Factores de crec. SUPLEMENTO Estimulo especifico *Bicarbonato *Indicador: Rojo Fenol Mantiene el PH BUFFER

2) FACTORES FISICOQUIMICOS PH: 7.2-7.5 OSMOLARIDAD : 280-320mOsmol/kG CO2: 2-5 % TEMPERATURA: 35-37 ºC 3) ESTERILIDAD 1) Manipulación de células en flujo laminar 2) Exposición de luz UV dentro del gabinete del flujo por 15´ antes de empezar a trabajar 3) Todo el material usado debe estar estéril * por autoclavado (120 C, 1 atm, 20´) en el caso de tips, frascos, eppendorfs, pipetas, etc. * por filtración (poro de 0,2µM) en el caso de medio (antes del agregado de SFB y antibióticos), buffers, agua, etc. 4) Todo los elementos que ingresan al flujo laminar deben ser lavados con etanol 70%

Tipos de transfección: 1) Coprecipitación por fosfato de calcio 2) Electroporación 3) DEAE-Dextran y Polibreno 4) Fusión de protoplastos 5) Lípidos cationicos (Liposomas) 6) Métodos Mecánicos *Microinjección *Biobalistica (gene gun)

Fijación La función de la fijación es preservar la morfología celular y la localización y estructura de los antigenos lo mas fielmente posible a lo que ocurre en la realidad. Gluteraldheído Paraformaldheido Metanol/Acetona Modo de acción Por puentes entre grupos aminos de las proteínas Por puentes entre grupos aminos de las proteínas Por precipitación de proteínas y carbohidratos Uso mas frecuente Microscopia electrónica y algunos estudios de fluorescencia Ampliamente usado para estudios de fluorescencia e inmunocitoquímicos Gran variedad de estudios ventajas/ desventajas *provee la mayor preservación de la estructura fina *es el mas severo delos fijadores *en gral. Altera los epitopes *provoca fluorescencia inespecifica *produce menor autofluorescencia que el gluteraldheído *menor cantidad de puentes que el gluteraldheído *penetra mas rápidamente dentro de la célula. *fijación mas rápida que el aldheído *frecuentemente altera el patrón de localización de antígenos *antígenos solubles pueden perderse *contracción de la muestra

Micela de detergente e agua PERMEABILIZACION Micela de detergente e agua

Ruptura de la membrana por detergente.

ANTICUERPOS Los anticuerpos son proteínas que tienen la capacidad reconocer y unirse específicamente y con alta afinidad a otras proteínas . La molécula que induce la producción de anticuerpos se denomina antígeno. Cada antígeno suele presentar varios determinantes antigénicos o epitopes.

Anticuerpos Policlonales Monoclonales Anticuerpos producidos por diferentes clones de linfocitos Mezcla heterogénea de anticuerpos, reconocen distintos epitopes de un mismo antígeno. Policlonales Monoclonales Anticuerpos producidos por un único clon de linfocitos Población de anticuerpos homogéneos, reconoce un único epitope del anticuerpo

Anticuerpos policlonales Conejo, cabra, oveja, etc. Purificación de anticuerpos Separar el suero

Anticuerpos monoclonales Se obtienen inmortalizando linfocitos B, por fusión con células de mieloma de ratón. Las células fusionadas (hibridomas) producirán inmunoglobulinas idénticas a las que producía el linfocito B normal parental y es inmortal como el mieloma que le dio origen.

Anticuerpos monoclonales Células de mieloma Fusión Células productoras de anticuerpos hibridomas Producción de anticuerpos monoclonales

Anticuerpos monoclonales Ventajas con respecto a los policlonales: Alta especificidad, reconocen un único epitope Se pueden obtener en cantidades ilimitadas con las mismas características. Desventajas: Mayor costo

Inmunofluorescencia DIRECTA INDIRECTA primario secundario Anticuerpo marcado con fluoróforo primario secundario Ventajas Mayor sensibilidad El anticuerpo secundario puede ser usado para localizar cualquier anticuerpo primario producido en el mismo animal para el cual fue hecho el secundario

Inmunofluorescencia indirecta Células fijadas y permeabilizadas

Inmunofluorescencia indirecta Células fijadas, permeabilizadas y bloqueadas

Inmunofluorescencia indirecta Anticuerpo primario (IgG) anti-tubulina (producido en conejo) anti-vinculina (producido en conejo)

Inmunofluorescencia indirecta Anticuerpo secundario Anti-Conejo (producido en cabra)

Inmunofluorescencia indirecta Microscopio de fluorescencia

GFP-PTP 1B DA VINCILUNA

ACTINA/NUCLEO/RETICULO

VINCULINA/NUCLEO/RETICULO

MICROTUBULOS/NUCLEO/VESICULAS