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Microscopía y técnicas de estudio a nivel celular

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Presentación del tema: "Microscopía y técnicas de estudio a nivel celular"— Transcripción de la presentación:

1 Microscopía y técnicas de estudio a nivel celular

2 Ópticos Tipos de microscopios Electrónicos Campo claro Campo Oscuro
Microscopía Campo claro Campo Oscuro Contraste de fase Confocal Fluorescencia Ópticos Tipos de microscopios Electrónicos Transmisión Barrido

3 Distancia mínima a la cual el equipo puede mostrar
Algunos Conceptos… Magnificación Resolución (D) Aumento que logra el equipo Distancia mínima a la cual el equipo puede mostrar dos puntos como entidades separadas

4 ¿De qué depende la resolución?
Algunos Conceptos… ¿De qué depende la resolución? 0,5 . λ D = n . senθ ¿Cómo disminuir D?

5 ¿De qué depende la resolución?
Algunos Conceptos… ¿De qué depende la resolución? λ FILTRO AZUL Longitud de onda del haz de luz 0,5 . D = n . senθ

6 ¿De qué depende la resolución?
Algunos Conceptos… ¿De qué depende la resolución? 0,5 . λ D = senθ n . q Objetivo muestra LENTE CON AN MAYOR

7 ¿De qué depende la resolución?
Algunos Conceptos… ¿De qué depende la resolución? Es el cambio de dirección que experimenta un rayo de luz cuando pasa de un medio transparente a otro también transparente. Este cambio de dirección está originado por la distinta velocidad de la luz en cada medio. nAire: 1 nAceite:1,5 0,5 . λ D = n . senθ Índice de refracción ACEITE DE INMERSIÓN

8 Microscopio óptico TORNILLOS DE REVOLVER EL PORTAOBJETOS

9 Microscopio óptico

10 Microscopio óptico - Campo claro
Eosinofilia

11 Observar organismos vivos sin necesidad de tinción Objetos brillantes
Microscopio óptico - Campo oscuro Objetos brillantes sobre un fondo oscuro Observar organismos vivos sin necesidad de tinción

12 Microscopio óptico - Campo oscuro
Treponema pallidum

13 Microscopio óptico - Contraste de fase
Aumenta pequeñas diferencias en el índice de refracción y densidad en la célula Observar organismos vivos sin necesidad de tinción El anillo forma un cono hueco de luz. El rayo de luz que atraviese la muestra va a retrasarse respecto del rayo que siga de largo luz sombra

14 Microscopio óptico - Contraste de fase

15 Microscopio óptico - Contraste de fase
Células HeLa (Henrietta Lacks) Eritrocitos Humanos Zygnema Filamentous Algae

16 Permite la visualización detallada sin teñir
Microscopio óptico - Interferencia Mismo principio que el microscopio de contraste de fase pero utiliza luz polarizada Permite la visualización detallada sin teñir Maximiza la diferencia entre los índices de refracción entre las partes de la muestra de forma de hacer visibles los limites celulares

17 Microscopio óptico - Contraste de fase e interferencia
diferencial

18 Microscopio óptico - Fluorescencia
Los objetos pueden también visualizarse por la luz que ellos mismos emiten Restringe infrarrojo Pasa sólo la λ que permite la excitación del fluorocromo

19 (Green fluorescent protein)
Microscopio óptico - Fluorescencia Algunos “objetos” fluorescentes… GFP (Green fluorescent protein) Aequoria victoria

20 Drpspphila hela Célula de cebolla (peroxisomas)

21 Microscopio óptico - Fluorescencia - Confocal

22 Microscopio óptico - Fluorescencia - Confocal

23 Microscopio óptico - Fluorescencia - Confocal

24 Microscopía electrónica - Microscopio electrónico de transmisión (TEM)

25 Microscopía electrónica - Microscopio electrónico de transmisión (TEM)
Bacilos en división Mitocondria x Bacteria fagocitada por un macrófago Herpes virus ensamblándose en el núcleo

26 Microscopía electrónica - Microscopio electrónico de barrido (SEM)

27 Microscopía electrónica - Microscopio electrónico de barrido (SEM)
Glomérulo renal 1200x Espermatozoides bovinos Piel humana Célula en corte transversal

28 Microscopía electrónica - Microscopio electrónico de barrido (SEM)
Bacterias sobre un estoma Célula vegetal con cristales (falsa tinción) Glób. Rojo Glób. Blanco

29 Proporciona resultados de amplia resolución y magnificación
Microscopía electrónica - Ventajas y desventajas Elevados costos de los equipos  y una infraestructura adecuada no permiten el uso de la técnica en cualquier laboratorio. Altos costos de procesamiento de las muestras La manipulación de reactivos se  torna peligroso por la elevada condición toxica de los mismos. Procesamiento tedioso de la muestra. Creación de artefactos La complejidad de los equipos requiere de personal técnico especializado. Proporciona resultados de amplia resolución y magnificación

30 Técnicas inmunológicas

31 Introducción a las Técnicas inmunológicas
ELISA Western blot Inmunohistoquímica Inmunofluorescencia Citometría de flujo

32 Técnicas inmunológicas - Inmunoglobulinas

33 Anticuerpo Antígeno Linfocito B Activación
Técnicas inmunológicas - Anticuerpos Anticuerpo Linfocito B epitope Activación Antígeno

34 Antígeno Epitope A Epitope C Epitope B
Técnicas inmunológicas - Anticuerpos Antígeno Epitope A Epitope C Epitope B

35 Técnicas inmunológicas - Anticuerpos policlonales
Antigeno Activación Linfocitos B

36 Sangre Suero Técnicas inmunológicas - Anticuerpos policlonales
Centrifugación Suero Purificación

37 Técnicas inmunológicas - Anticuerpos policlonales

38 + Fusión Técnicas inmunológicas - Anticuerpos monoclonales Antígeno
Cultivo de células tumorales Sangrado + Purificación de Linfocitos B Fusión Hibridoma

39 Técnicas inmunológicas - Anticuerpos monoclonales
Hibridomas Screening: Búsqueda de hibridoma positivo y aislamiento Purificación de anticuerpos monoclonales del sobrenadante de cultivo de los hibridomas

40 Para detectar Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ELISA
Antígenos Anticuerpos

41 ELISA Para detectar Anticuerpos
Sensibilización Bloqueo Incubación con Suero

42 ELISA Para detectar Anticuerpos
Lavado Anticuerpo 2º Revelado

43 ELISA Para detectar Antígenos
Sensibilización Bloqueo Incubación con Suero

44 ELISA Para detectar Antígenos
Lavado Anticuerpo 2º Revelado

45 ELISA

46 Técnicas inmunológicas - Detección indirecta

47 Técnicas inmunológicas - Complejo avidina/biotina

48 Técnicas inmunológicas - Detección indirecta
Antígeno Ac. primario Ac. secundario Biotina Avidina Peroxidasa Cromógeno Cromóforo

49 Western blot Western blot SDS PAGE Gel Transferencia Membrana

50 Western blot Bloqueo Anticuerpo 1º Anticuerpo 2º biotinilado
Avidina-peroxidasa Revelado Sustrato coloreado que precipita al reaccinar Sustrato que emite luz al reaccionar con la enzima

51 Inmunohistoquímica Anticuerpo 1º Anticuerpo 2º biotinilado
Se corta en secciones muy finas y se coloca en un portaobjetos Trozo de tejido Anticuerpo 1º Anticuerpo 2º biotinilado Avidina-peroxidasa Revelado

52 Inmunohistoquímica - Sustratos

53 Inmunohistoquímica - Revelado
Anti MMP-13 revelado con DAB Contratinción hematoxilina

54 Inmunofluorescencia Fluoresceina Ficoeritrina Rodamina Naranja
de Acridina DAPI Bromuro de Etidio

55 Inmunofluorescencia Rat neurons N-myc/CD56

56 Inmunofluorescencia - colocalización
La colocalización permite determinar si dos antígenos se encuentran en el mismo lugar (nucleo, vacuola, retículo, etc) dentro de una célula

57 Inmunofluorescencia - colocalización

58 Citometría de Flujo Citometría de Flujo Célula Medida En movimiento Medida de las propiedades de las células mientras están en un flujo de líquido Inmunofenotipificación Viabilidad/apoptosis/Proliferación Ciclo celular Cambios en la superficie Actividad enzimática

59 Citometría de Flujo Marcación con anticuerpos monoclonales Mezcla de células

60 Citometría de Flujo La presión ejercida por una columna de fluido obliga a las células a “enfilarse” de a una

61 Citometría de Flujo Columna de células

62 Citometría de Flujo Laser Detector

63 Granularidad Tamaño Citometría de Flujo
La luz que se detecta a 90 grados del haz del laser (side) es detectada por el canal Side Scatter Channel (SSC) La intensidad de la señal es proporcional a la cantidad de estructuras citosólicas en la célula (gránulos, inclusiones, etc) Granularidad Tamaño La luz que se detecta en la misma dirección del laser (forward) es detectada por el canal Forward Scatter Channel (FSC). La intensidad de la señal detectada se relaciona con el tamaño, y el indice de refracción de las células

64 Citometría de Flujo Dado que FSC es proporcional al tamaño y SSC a las estructuras internas, una correlación entre ellos permiten la diferenciación de los distintos tipos celulares en una población celular heterogenea FSC SSC Granulocitos Linfocitos Monocitos RBCs, debris, Células muertas

65 Intensidad de fluorescencia
Citometría de Flujo - Histograma Cuentas Intensidad de fluorescencia

66 Citometría de Flujo - Dot Plot

67 Citometría de Flujo - Dot Plot

68 Citometría de Flujo - Cell sorting

69 Citometría de Flujo

70 Citometría de Flujo


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