Descargar la presentación
La descarga está en progreso. Por favor, espere
Publicada porJunípero Fontan Modificado hace 10 años
1
Microscopía y técnicas de estudio a nivel celular
2
Ópticos Tipos de microscopios Electrónicos Campo claro Campo Oscuro
Microscopía Campo claro Campo Oscuro Contraste de fase Confocal Fluorescencia Ópticos Tipos de microscopios Electrónicos Transmisión Barrido
3
Distancia mínima a la cual el equipo puede mostrar
Algunos Conceptos… Magnificación Resolución (D) Aumento que logra el equipo Distancia mínima a la cual el equipo puede mostrar dos puntos como entidades separadas
4
¿De qué depende la resolución?
Algunos Conceptos… ¿De qué depende la resolución? 0,5 . λ D = n . senθ ¿Cómo disminuir D?
5
¿De qué depende la resolución?
Algunos Conceptos… ¿De qué depende la resolución? λ FILTRO AZUL Longitud de onda del haz de luz 0,5 . D = n . senθ
6
¿De qué depende la resolución?
Algunos Conceptos… ¿De qué depende la resolución? 0,5 . λ D = senθ n . q Objetivo muestra LENTE CON AN MAYOR
7
¿De qué depende la resolución?
Algunos Conceptos… ¿De qué depende la resolución? Es el cambio de dirección que experimenta un rayo de luz cuando pasa de un medio transparente a otro también transparente. Este cambio de dirección está originado por la distinta velocidad de la luz en cada medio. nAire: 1 nAceite:1,5 0,5 . λ D = n . senθ Índice de refracción ACEITE DE INMERSIÓN
8
Microscopio óptico TORNILLOS DE REVOLVER EL PORTAOBJETOS
9
Microscopio óptico
10
Microscopio óptico - Campo claro
Eosinofilia
11
Observar organismos vivos sin necesidad de tinción Objetos brillantes
Microscopio óptico - Campo oscuro Objetos brillantes sobre un fondo oscuro Observar organismos vivos sin necesidad de tinción
12
Microscopio óptico - Campo oscuro
Treponema pallidum
13
Microscopio óptico - Contraste de fase
Aumenta pequeñas diferencias en el índice de refracción y densidad en la célula Observar organismos vivos sin necesidad de tinción El anillo forma un cono hueco de luz. El rayo de luz que atraviese la muestra va a retrasarse respecto del rayo que siga de largo luz sombra
14
Microscopio óptico - Contraste de fase
15
Microscopio óptico - Contraste de fase
Células HeLa (Henrietta Lacks) Eritrocitos Humanos Zygnema Filamentous Algae
16
Permite la visualización detallada sin teñir
Microscopio óptico - Interferencia Mismo principio que el microscopio de contraste de fase pero utiliza luz polarizada Permite la visualización detallada sin teñir Maximiza la diferencia entre los índices de refracción entre las partes de la muestra de forma de hacer visibles los limites celulares
17
Microscopio óptico - Contraste de fase e interferencia
diferencial
18
Microscopio óptico - Fluorescencia
Los objetos pueden también visualizarse por la luz que ellos mismos emiten Restringe infrarrojo Pasa sólo la λ que permite la excitación del fluorocromo
19
(Green fluorescent protein)
Microscopio óptico - Fluorescencia Algunos “objetos” fluorescentes… GFP (Green fluorescent protein) Aequoria victoria
20
Drpspphila hela Célula de cebolla (peroxisomas)
21
Microscopio óptico - Fluorescencia - Confocal
22
Microscopio óptico - Fluorescencia - Confocal
23
Microscopio óptico - Fluorescencia - Confocal
24
Microscopía electrónica - Microscopio electrónico de transmisión (TEM)
25
Microscopía electrónica - Microscopio electrónico de transmisión (TEM)
Bacilos en división Mitocondria x Bacteria fagocitada por un macrófago Herpes virus ensamblándose en el núcleo
26
Microscopía electrónica - Microscopio electrónico de barrido (SEM)
27
Microscopía electrónica - Microscopio electrónico de barrido (SEM)
Glomérulo renal 1200x Espermatozoides bovinos Piel humana Célula en corte transversal
28
Microscopía electrónica - Microscopio electrónico de barrido (SEM)
Bacterias sobre un estoma Célula vegetal con cristales (falsa tinción) Glób. Rojo Glób. Blanco
29
Proporciona resultados de amplia resolución y magnificación
Microscopía electrónica - Ventajas y desventajas Elevados costos de los equipos y una infraestructura adecuada no permiten el uso de la técnica en cualquier laboratorio. Altos costos de procesamiento de las muestras La manipulación de reactivos se torna peligroso por la elevada condición toxica de los mismos. Procesamiento tedioso de la muestra. Creación de artefactos La complejidad de los equipos requiere de personal técnico especializado. Proporciona resultados de amplia resolución y magnificación
30
Técnicas inmunológicas
31
Introducción a las Técnicas inmunológicas
ELISA Western blot Inmunohistoquímica Inmunofluorescencia Citometría de flujo
32
Técnicas inmunológicas - Inmunoglobulinas
33
Anticuerpo Antígeno Linfocito B Activación
Técnicas inmunológicas - Anticuerpos Anticuerpo Linfocito B epitope Activación Antígeno
34
Antígeno Epitope A Epitope C Epitope B
Técnicas inmunológicas - Anticuerpos Antígeno Epitope A Epitope C Epitope B
35
Técnicas inmunológicas - Anticuerpos policlonales
Antigeno Activación Linfocitos B
36
Sangre Suero Técnicas inmunológicas - Anticuerpos policlonales
Centrifugación Suero Purificación
37
Técnicas inmunológicas - Anticuerpos policlonales
38
+ Fusión Técnicas inmunológicas - Anticuerpos monoclonales Antígeno
Cultivo de células tumorales Sangrado + Purificación de Linfocitos B Fusión Hibridoma
39
Técnicas inmunológicas - Anticuerpos monoclonales
Hibridomas Screening: Búsqueda de hibridoma positivo y aislamiento Purificación de anticuerpos monoclonales del sobrenadante de cultivo de los hibridomas
40
Para detectar Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ELISA
Antígenos Anticuerpos
41
ELISA Para detectar Anticuerpos
Sensibilización Bloqueo Incubación con Suero
42
ELISA Para detectar Anticuerpos
Lavado Anticuerpo 2º Revelado
43
ELISA Para detectar Antígenos
Sensibilización Bloqueo Incubación con Suero
44
ELISA Para detectar Antígenos
Lavado Anticuerpo 2º Revelado
45
ELISA
46
Técnicas inmunológicas - Detección indirecta
47
Técnicas inmunológicas - Complejo avidina/biotina
48
Técnicas inmunológicas - Detección indirecta
Antígeno Ac. primario Ac. secundario Biotina Avidina Peroxidasa Cromógeno Cromóforo
49
Western blot Western blot SDS PAGE Gel Transferencia Membrana
50
Western blot Bloqueo Anticuerpo 1º Anticuerpo 2º biotinilado
Avidina-peroxidasa Revelado Sustrato coloreado que precipita al reaccinar Sustrato que emite luz al reaccionar con la enzima
51
Inmunohistoquímica Anticuerpo 1º Anticuerpo 2º biotinilado
Se corta en secciones muy finas y se coloca en un portaobjetos Trozo de tejido Anticuerpo 1º Anticuerpo 2º biotinilado Avidina-peroxidasa Revelado
52
Inmunohistoquímica - Sustratos
53
Inmunohistoquímica - Revelado
Anti MMP-13 revelado con DAB Contratinción hematoxilina
54
Inmunofluorescencia Fluoresceina Ficoeritrina Rodamina Naranja
de Acridina DAPI Bromuro de Etidio
55
Inmunofluorescencia Rat neurons N-myc/CD56
56
Inmunofluorescencia - colocalización
La colocalización permite determinar si dos antígenos se encuentran en el mismo lugar (nucleo, vacuola, retículo, etc) dentro de una célula
57
Inmunofluorescencia - colocalización
58
Citometría de Flujo Citometría de Flujo Célula Medida En movimiento Medida de las propiedades de las células mientras están en un flujo de líquido Inmunofenotipificación Viabilidad/apoptosis/Proliferación Ciclo celular Cambios en la superficie Actividad enzimática
59
Citometría de Flujo Marcación con anticuerpos monoclonales Mezcla de células
60
Citometría de Flujo La presión ejercida por una columna de fluido obliga a las células a “enfilarse” de a una
61
Citometría de Flujo Columna de células
62
Citometría de Flujo Laser Detector
63
Granularidad Tamaño Citometría de Flujo
La luz que se detecta a 90 grados del haz del laser (side) es detectada por el canal Side Scatter Channel (SSC) La intensidad de la señal es proporcional a la cantidad de estructuras citosólicas en la célula (gránulos, inclusiones, etc) Granularidad Tamaño La luz que se detecta en la misma dirección del laser (forward) es detectada por el canal Forward Scatter Channel (FSC). La intensidad de la señal detectada se relaciona con el tamaño, y el indice de refracción de las células
64
Citometría de Flujo Dado que FSC es proporcional al tamaño y SSC a las estructuras internas, una correlación entre ellos permiten la diferenciación de los distintos tipos celulares en una población celular heterogenea FSC SSC Granulocitos Linfocitos Monocitos RBCs, debris, Células muertas
65
Intensidad de fluorescencia
Citometría de Flujo - Histograma Cuentas Intensidad de fluorescencia
66
Citometría de Flujo - Dot Plot
67
Citometría de Flujo - Dot Plot
68
Citometría de Flujo - Cell sorting
69
Citometría de Flujo
70
Citometría de Flujo
Presentaciones similares
© 2024 SlidePlayer.es Inc.
All rights reserved.