Linfocitos Fagocitos Sistema inmune Algunas células capturan microorganismos y otros antígenos que presentan a los linfocitos

1.Enteropatía por sensibilidad al gluten Definición de Enfermedad celíaca 1.Enteropatía por sensibilidad al gluten 2.Trastorno inflamatorio multiorgánico: mediado por el sistema inmune y desencadenado por la ingestión de gluten (y otras prolaminas) en individuos genéticamente predispuestos, aparición a cualquier edad, distribución mundial, caracterizado por la presencia de autoanticuerpos, con o sin manifestaciones clínicas o enteropatía. Falta integrar conocimiento sobre patogenia. Los tests serológicos (nuevos, mejores, muy disponibles) han permitido: mejor definición de la historia natural de EC, y mejor conocimiento del amplio espectro de manifestaciones clínicas y su relación con la lesión histológica. Basado en Troncone et al, CDEUSSA 2008

Prioridades en la Enfermedad celíaca * Revisar los criterios diagnósticos Integrar marcadores serológicos, genéticos, histológicos * Mejorar protocolos de uso de la serología (Sería necesario identificar marcadores de uso diagnóstico que no se relacionen con la ingestión de gluten) * Promover conocimiento de la enfermedad, mejorar detección y tratamiento precoz * Aumentar la adherencia a dieta sin gluten * Identificar los mecanismos patogénicos * Desarrollar terapias complementarias Basado en R. Troncone JPGN 2004

Factores implicados en la inmuno- patogenia de la enfermedad celíaca Extrínsecos Gluten/trigo prolaminas Intrínsecos Infecciones, Lactancia, flora? Hipersensibilidad tipo IV Linfocitos T CD4+ Autoanticuerpos Citotoxicidad En último término, la patogenia parece depender de 2 mecanismos integrados pero diferentes: 2 señales generadas por la inmunidad innata y adaptativa (mediada por células T) Genéticos HLA-DQ2/DQ8 Genes no-HLA Inmunológicos Pérdida de tolerancia oral? EA2009

a-gliadina 19mer LGQQQPFP------------PQ------------QP------YPQPQPF Aminoácidos hidrofóbicos seguidos de resíduos de Prolina bloquean la acción de las peptidasas Riqueza en Glutamina y Prolina LGQQQPFP------------PQ------------QP------YPQPQPF L – QLQPFPQPELPYPQPELPYPQPELPYPQPQPF 19mer 33mer

Susceptibilidad genética asociada a HLA DQB1 DQA1 02 05 DR3 b a cis 0301 DR5 trans 0201 DR7 0302 DR4 HLA-DQ(a1*05,b1*02) HLA-DQ(a1*03,b1*0302) DQ2 DQ8 El papel funcional de la molécula HLA-DQ2 en la EC está bien definido y explica la asociación genética Máximo riesgo en homozigotos DR3-DQ2 o combinación DR2-DQ2 con DR7-DQ2 Sollid LM. et al. J Exp Med 1989

Célula presentadora de antígeno CD4 DQ2 Linfocito T

Efecto dosis del dímero DQ2.5 La molécula HLA-DQ2 presenta péptidos de gliadinas a los linfocitos T CD4+ CD4 TCR 02 05 DR3 b a DQB1 DQA1 HLA-DQ2 (ab) Linfocito T Transglutaminasa modifica la gliadina gliadina El papel funcional de la molécula HLA-DQ2 en la EC está bien definido y explica la asociación genética Efecto dosis del dímero DQ2.5 Número/calidad de moléculas DQ2 mejoran la presentación de péptidos

TCR ab HLA-DQ2 E Control genético de la Inmunidad específica al gluten CD4 DQ2 TCR HLA-DQ2 TCR ab 7 1 Q S F P R 4 6 9 E H - TGt induce deamidación PQQPQQSFPQQQRP HLA-DQ2 EA2009

Frecuencia de HLA-DQ2 y otros alelos en la población de Castilla y León 25% DQ2+ DQ2 negativos: 6% en España 14% Finlandia Alrededor del 10% de familiares DQ2+ desarrollan la EC Arranz E. J Clin Immunogenet 1997; Polvi A-Arranz E. Hum Immunol 1998

Basado en Kagnoff MF. J Clin Invest 2007 Susceptibilidad genética: sistema HLA contribuye <40% (Otros genes: relacionados con la función inmunológica) HLA-DQ(a1*05,b1*02) HLA-DQ(a1*03,b1*0302) Población general Individuos con E. celíaca Expresión HLA-DQ2/8 Solo el 2% de portadores HLA-DQ2+ desarrollan EC Basado en Kagnoff MF. J Clin Invest 2007

Genes HLA y no-HLA en enfermedad celíaca Otros en región HLA: genes MICA, MICB, TNF (desequilibrio ligamiento)

Enfermedad celíaca: modelo en 2 señales Péptido de gliadina 33-mer Péptido 19-mer IL-15 Péptido de gliadina 33-mer IL-15Ra HLA-clase I 1 CD8 CD71 MICA KGF MMP NKG2D TGt 1) Procesamiento y selección de péptidos (proteolisis, TGt); 2) Activación de linfocitos T reactivos (reconocimiento de péptidos/ moleculas HLA-DQ, producción de citoquinas); 3) Lesión o transformación mucosa (mediadores: MMP, KGF). Th1 2 IFNg TCRab CD4 DQ2 B Anticuerpos NLM EA2009 18

Datos conocidos en la patogenia 1. Digestión incompleta del gluten con acúmulo de fragmentos ricos en glutamina y prolina 2. Efecto doble del gluten sobre el intestino interviene la Inmunidad Innata en epitelio (citolisis), y la I. Adaptativa en la lámina propia (linfocitos T CD4+) 3. La transglutaminasa modifica el gluten deamidación de péptidos, aumento de inmunogenicidad 4. La molécula HLA-DQ une ciertos péptidos restricción en la presentación de péptidos a linfocitos T 5. Producción de citocinas proinflamatorias Balance alterado. Pérdida de tolerancia. Remodelación EA2009

Tipo 0 Tipo 1 Tipo 3 Tipo 2 Tipo 4 a b Marsh MN (1993) Gastroenterology Espectro de cambios progresivos. Lesión reversible (al contrario de otras patologías inflamatorias crónicas del intestino) Análisis morfométrico de la mucosa del intestino delgado: evaluación vellosidad/cripta, recuentos de LIE Espectro de cambios histológicos asociados al gluten (reversibles)

Modelo de cultivo ex vivo de explante de biopsia Medio de cultivo Antígenos, péptidos Determinación de proteínas Estudios histológicos Aislamiento celular Aislamiento y purificación de poblaciones celulares EDTA DTT colagenasa Ficoll EA2006

Respuesta Th1 con predominio de IFNg Niveles mRNA de IFNg y cociente IFNg/TGFb Biopsias sin cultivar Correlación con el grado de lesión León AJ et al. Clin Exp Immunol 2006;146:479-85

IL-18 podría mantener las respuestas Th1 b a.Niveles mRNA de IL-18. Biopsia sin cultivar b.Inmunohistoquimia en secciones (criptas) Densitometría: bandas de IL-18 (18 kDa) Células dendríticas del intestino celíaco expresan niveles altos de IL-18 e IFNa (pero no de IL-12p40) Análisis por Western blot: 1-6 EC activa, 7-8 controles, 9-10 patológicos León AJ et al. Clin Exp Immunol 2006;146:479-85

Expresión de IL-15 en biopsias de duodeno a. Niveles mRNA de IL-15 en biopsias sin cultivar (pacientes, controles) b. Inmunohistoquimia: células mononucleares en lámina propria Western blot: EC activa 1-4, control patológico 5-6, control normal 7-8 León AJ et al. Clin Exp Immunol 2006;146:479-85

Gliadina induce IL-15 en cultivo de biopsia Sobrenadante de cultivo (24h) Extracto biopsia Bernardo D. et al. Gut 2007; Clin Exp Immunol 2008 a b Expresión mRNA de IL15Rα (Biopsia sin cultivo) La respuesta al péptidos de gliadina mediada por la inmunidad innata, con producción de IL-15 puede estar generalizada a todos los individuos

Biopsias: controles no-EC (1,2), EC activa (3,4), en DSG (5) 92 82 35 33 26 24 20 1 2 3 4 5 Zimograma: técnica electroforética, para revelar bandas que degradan el mismo sustrato. Enzimas post-prolina (bacterias) Matrix Metallopeptidasa-9 MMP9, M10.004, 92 kDa Prolyl Oligopeptidase POP, S09.001, 80,7 kDa Dipeptidyl—peptidase II DPP7, S28.002, 54,3 kDa Proline-specific peptidyldipeptidase Streptomyces, M9D.002 Biopsias: controles no-EC (1,2), EC activa (3,4), en DSG (5) Pacientes muestran 7 perfiles con actividad degradadora gliadina de origen bacteriano Los pacientes EC presentan un perfil de 7 enzimas (92kDa, 82kDa, 35kDa, 33kDa, 26kDa, 24kDa, 20kDa) con actividad gliadinasas de naturaleza metaloproteasa y origen en la flora duodenal Bernardo D et al. Gut 2009;58:887-7 27

Posibles tratamientos complementarios Estrategias de tipo cuantitativo: Paliativas, impiden la llegada del gluten al intestino a) Generación de cereales no inmunogénicos Selección de cultivos. Modificación genética de cereales b) Destrucción del gluten, o bloqueo de su entrada Enzimas proteolíticos. Ligandos (Acs). Bloqueo de zonulina 2. Estrategias de tipo cualitativo: Tratan la causa, modifican la respuesta al gluten a) Inhibición de la respuesta adaptativa: TGt, HLA-DQ2 b) Bloqueo de mediadores: antagonistas de CCR, a4b7, citocinas (IL15, IFNg, IL21, otras), TNFa (en EC refractaria) c) Inducción de tolerancia: falta por identificar epítopos dominantes y estrategias eficaces (Sobre células dendríticas) Falta un modelo animal: para estudiar eficacia, toxicidad/seguridad

Posibles puntos de intervención terapéutica Anticuerpos anti-gluten Péptidos de gluten Anticuerpos anti-gluten IL15 zonulina IL15Ra HLA-clase I CD8 MICA tolerancia NKG2D TGt IL21 1) Procesamiento y selección de péptidos (proteolisis, TGt); 2) Activación de linfocitos T reactivos (reconocimiento de péptidos/ moleculas HLA-DQ, producción de citoquinas); 3) Lesión o transformación mucosa (mediadores: MMP, KGF). Th1 IFNg TCRab CD4 DQ2 B Anticuerpos EA2008 29

Inmunoterapia en la enfermedad celíaca Vacuna ¿realidad o ciencia ficción? -Podría elegirse entre la dieta sin gluten o la vacuna, aunque su eficacia sería de alrededor de 3 años -Sólo para pacientes DQ2/DQ8+ y Biopsia confirmada -Actúa sobre la respuesta inmune adaptativa -Criterios similares a la inmunoterapia utilizada en alergia y enfermedades autoinmunes -Problemas: es una inyección! ¿Cómo controlar la inmunidad innata al gluten? ¿Qué dosis utilizar y cuál es la vía óptima? ¿Qué péptido/epitopo T elegir ? (eficacia x3) Role of IL-15 in the epithelium of patients with CD 2c Objetivo: re-inducción de la tolerancia al gluten EA2006 30

Epítopos estimuladores de los linfocitos T CD4+ Péptido origen HLA TG2 secuencia Glia (206-217) gliadina DQ8 parcial SGQGSFQPSQQN Glt (723-735) glutenina DQ8 no QQGYYPTSPQQSG Glia-g1 (138-153) gliadina DQ2 si QPQQPQQSFPQQQRP Glia-a2 (62-75) gliadina DQ2 si PQPQLPYPQPQLPY Glia-a9 (57-68) gliadina DQ2 si QLQPFPQPQLPY Glia-a-20 (93-106) gliadina DQ2 si PFRPQQPYPQPQPQ Glt-156 (40-59) glutenina DQ2 si QPPFSQQQQSPFSQ Glt-17 (46-60) glutenina DQ2 si QPPFSQQQQSPFSQ Glia-g30 (222-236) gliadina DQ2 no VQGQGIIQPQQPAQL La identificación de DQ2/DQ8 ha permitido identificar gran número de secuencias “tóxicas” en prolaminas, etc. (Basado en Vader 2002, Koning 2003)

Posible mecanismo de Tolerancia oral Antígenos solubles (dieta) y de la flora comensal Epitelio TSLP RA PGE2 TLR Th3 a4b7 CCR9 Supresión de respuestas Th1 Tr1 IL-10 TGFb Anticuerpos CPA TGFb Cytokine production by mucosal T helper cells in response to oral antigens, and role of mucosal dendritic cells CD80/86 CD28 MHC CD4+ TCR IL-10 16

Bloqueo de mediadores: estrategias combinadas IL15 Gliadina LIE MICA NKG2D CCL20 IL15 IFNg IL21 Treg Role of IL-15 in the epithelium of patients with CD Th1 IFNa *IL15 e IL21 potencian respuestas CD4+ Th1. Activan a LIE CD8+ *IL21 estimula liberación MMP (fibroblastos) y producción CCL20 *IL21 inhibe maduración de CDs; y expresión de NKG2D por LIE 33 33