La Biopsia Renal “Estado del arte” Rafael Enrique Andrade Departamento de Patología Fundación Santafé de Bogotá Universidad Nacional de Colombia, Universidad de la Andes Medellín, Agosto de 2005

Guías prácticas para la biopsia renal “La biopsia renal nunca debe considerarse sin una valoración cuidadosa de sus riesgos y beneficios.Dada la importancia de un diagnóstico correcto en el tratamiento y pronóstico de la enfermedad renal, la evaluación histopatológica debe utilizar en su análisis todas las modalidades disponibles. Las biopsias de riñones nativos requieren exámen por microscopía de luz, inmunohiostoquímica (inmunofluorescencia) y microscopía electrónica”. Walker P.Modern Pathology (2004) 17, 1555–1563.

La Biopsia Renal Es definitivamente una herramienta, si no la más importante , en la definición de: la presencia de compromiso renal tipo de compromiso determinación de factores pronósticos favorables o desfavorables. Bajo esta circunstancia la participación activa del Nefrólogo, Radiólogo, Patólogo y otros intermediarios es indispensable en la obtención de la “mejor muestra” para análisis

La Biopsia Renal Es un procedimiento relativamente sencillo, invasivo Tiene por objeto brindar al clínico y por ende al paciente la mayor información posible con respecto al diagnóstico y a la determinación de factores pronósticos cuando se presentan síntomas o signos de enfermedad renal Cómo, Cuándo, Para qué?

La Biopsia Renal Preanálíticos Analíticos Para obtener un resultado adecuado y cumplir a cabalidad sus objetivos es indispensable cumplir con una serie de factores: Preanálíticos Analíticos

La Biopsia Renal Factores preanálíticos: Decisión de toma de la biopsia, vía, operador N. R. C Manejo inmediato N. R. C Selección del material para estudio y división de la muestra. N.P Procesamiento adecuado P Elaboración de cortes para microscopia de luz T.P Elaboración de cortes para Inmunofluorescencia y selección de los marcadores T.P Selección del área glomerular para estudio de ultraestructura y cortes semifinos T.P N: Nefrólogo, R: Radiólogo, C: Cirujano, P: Patólogo, T: Técnico

Biopsia renal Manipulación al tomarla: Manipulación en el laboratorio: Manejarla con aguja ,o palillo no forceps no halar o estirar ,no colocar en gasa, no congelar. Colocar en SS o Medio de Cultivo, mantener en refrigeración: tiempo 2-6-8-10 horas. Mitchel-Glutaraldehido Manipulación en el laboratorio: Seleccionar primero para IF, posteriormente el tejido para luz y electrónica, cortar con cuchilla de un solo filo (afeitar) no bisturí. Medios de fijación: Formol al 10% bufferizado, Bouin, Duboscq – Brasil, Zenker, paraformaldehido al 4%, glutaraldehido.

Biopsia renal TEJIDO EN PARAFINA 1 MM ME FORMOL GLUTARALDEHIDO TEJIDO CONGELADO IF LM ME

Práctica común en diferentes laboratorios www. renalpathsoc Práctica común en diferentes laboratorios www.renalpathsoc.org : 75 laboratorios Numero de biopsias en promedio por Lab : 55-2937, Promedio de 549 y Media de 300 ( FSFB 1100) 23% Nativas y 73% Tx 89% Nativas y 11% Tx (FSFB 95%N / 5%Tx) Aguja 16/18: 71%, 72% dos cilindros Promedio longitud 1cm Separación del tejido: Microscopio de disección 70%, 20% al ojo, 4.5% Microscopio de Luz 75% Formol, 8% Bouin, 17% otros ML/MF: 94% , ML/MF/ME: 85%; ME siempre 51%, ME: Si adecuado 35%, ME: Si indicación clínica 15% 7% ME en transplantes, 90% Preservación del tejido

Microscopía de luz Procesamiento: Corto o usual Cortes de 2-3 µm Dos o tres cortes por lámina 11 cortes seriados. HE PAS PMS TM HE PAS PMS HE PAS PMS TM RC AT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 250 micras 250 micras

Inmunohistoquímica Tejido no fijado Tejido congelado Fresco en SSN Fijador de Mitchel Formol Controles Negativo Albúmina Interno IgG IgM IgA C3 C1q C4 Fibrina Kappa Lambda Amiloide Colágeno IV Subclases IgG Virus Fenotipo de linfocitos

Complemento y enfermedad renal Activación del complemento es característico del LES Deficiencias de C1q predispone a LES por deficiencia en el aclaramiento de células apoptosicos Clave en autoinmunidad Contribución de células dendríticas inmaduras y maduras IgG, C1q anti C1q Vía clásica: protector Vía alterna: Dañino

Práctica común en diferentes laboratorios RPS. ML: 9 Láminas 2-3 μ (FSFB 11) ML: 8 Láminas Tx (FSFB 11) HE / PAS / PLATA / TM IF : 90% IgG, IgA, IgM,C3 IF : 70% C1q, К λ, Fibrin IF : 50% Albúmina IF : 35% C4 20% IF en transplantes 75% C4d en transplantes

Microscopía electrónica Glutaraldehido entre 2 – 3% Paraformaldehido 1 – 4% Formol Fijadores con Mercurio Mitchel / Zeus Reprocesamiento de parafina o de IF Semifino 51% Michell, 44% SSN 83% Glutaraldehido ME

Fase analítica: Interpretación Glomérulo Túbulo Intersticio Vasos Conteo glomerular Celularidad Presencia de esclerosis global o Segmentaria Presencia de Crecientes (subtipo) Proliferación celular Exudado inflamatorio Membranas Mesangio etc.

Fase analítica: Interpretación Glomérulo Túbulo Intersticio Vasos 80% del volumen renal Componentes celulares Fibroblastos, células intersticiales ricas en lípidos, monocitos Células dendríticas Matriz Injuria primaria o secundaria Buena predicción de la severidad de la disfunción renal

Fase analítica: Interpretación Glomérulo Túbulo Intersticio Vasos Derivados de arteria renal Rica red, arterias arteriolas, capilar glomerular, arteriola eferente, red peritubular, vénulas y venas

Papel de la biopsia renal en algunas condiciones específicas

Papel de la biopsia renal en LES Controvertido entre nefrólogos y reumatólogos No tiene valor en el diagnóstico de la enfermedad Una vez hecho el diagnóstico es importante la determinación del compromiso y la actividad Principal objetivo es equiparar el tratamiento a la severidad de la enfermedad Provee información crítica del pronóstico a corto y largo plazo que correlaciona con intensidad y duración de la terapéutica Informa al paciente acerca de su enfermedad Tratamiento adecuado en clase IV sobrevida hasta 90% a cinco años Tratamiento inadecuado lleva lesiones activas se vuelvan crónicas Lupus Silencioso: Mayoría son clase II pero hay Clases IV y V Transformación Nefropatías sobreimpuestas: Cambios mínimos, GEFS, IgM, Amiloidosis, Nefropatía hipertensiva, Nefritis intersticial alérgica o a drogas, GN necrotizante.

Bases Fisiopatológicas de la Clasificación del L. E.S El espíritu de la nueva clasificación es tratar de aplicar nuevos conceptos de la patogénesis de las enfermedades renales en la interpretación de la biopsia renal y correlacionar sus hallazgos con síntomas clínicos, tratamiento y pronóstico La nueva propuesta tiende a eliminar inconsistencias y ambigüedades Kidney Int 2004, 65: 521-530

Characterization of heterogeneity in the Copyright © 2004, American Society for Clinical Investigation J Clin Invest. 2004 June 15; 113 (12): 1722–1733 Characterization of heterogeneity in the molecular pathogenesis of lupus nephritis from transcriptional profiles of laser-captured glomeruli Karin S. Peterson,1 Jing-Feng Huang,2 Jessica Zhu,2 Vivette D'Agati, 1. Department of Pediatrics, Columbia University, New York, New York, USA. 2. Johnson & Johnson Pharmaceutical Research and Development, San Diego, California, USA. 3. Department of Pathology, Columbia University, New York, New York, USA. 4OmniViz Inc., Maynard, Massachusetts, USA.

Clasificación Nefropatía Lúpica SOCIEDAD INTENACIONAL DE NEFROLOGIA/PATOLOGIA RENAL (INS/RPS) Kidney International 2004, 65: 521-530

Clase IV Clase IV es definida como una NEFRITIS PROLIFERATIVA DIFUSA comprometiendo mas del 50% de todos los glomérulos En los glomérulos afectados las lesiones proliferativas pueden ser segmentarias respetando por lo menos la mitad del penacho glomerular o globales cuando comprometan mas de la mitad del mismo. Subdivisión: difusa segmentaria (clase IV-S) cuando >50% de los glomérulos comprometidos tienen lesiones segmentarias difusa global (clase IV-G) cuando >50% de los glomérulos tienen lesiones globales . Kidney Int. 2004, 65: 521-530

Cambios Vasculares en LES Esclerosis arterial y arteriolar Presencia de complejos inmunes por IF/ME sin presencia de vasculitis o necrosis Necrosis vascular con fibrina: Vasculopatía (sin inflamación) Trombosis intravascular Microangiopatía Vasculitis Necrotizante tipo PAN

Cambios Intersticiales 50% Nefritis (menos frecuente en clase II) Depósitos en membranas tubulares Lineal sugiere antiMBT Linfocitos T (CD4= CD8), Monocitos, plasmocitos, linfocitos B Tubulitis Fibrosis

Cuáles son los factores pronósticos predictivos a largo termino en pacientes con nefritis lúpica ? Severidad de la enfermedad desde el punto de vista clínico (Proteinuria y niveles de creatinina) e histopatológico Características del paciente tales como edad, sexo, raza, estado socioeconómico y acceso a sistemas de salud Respuesta terapéutica

LES: Sobrevida 1970s Estes y Christian : Sobrevida a 5 años para pacientes con manifestaciones renales 50% vs. 75% para todos los pacientes con LES (68% con proliferación focal, y 28% con proliferación difusa y membranosa.) ( Prednisona) En las series de 1965-1998 (800 pacientes en SUNY/Brooklyn) la sobrevida para aquellos con enfermedad renal fue de 60% a 65% a 300-350 meses

LES: Sobrevida Reducción de la mortalidad a cambio de un incremento en la morbilidad (x 3) Un número importante de factores ha mostrado tener importancia critica en la predicción del pronostico adverso en pacientes con lupus severo en un estudio de 65 pacientes: Creatinina sérica inicial Niveles de Hb y Hc, Raza negra Presencia de fibrosis o medialunas en la biopsia

LES: Sobrevida Factores socioeconómicos En una serie de 128 pacientes evaluados en la Universidad de Columbia en New York, NY, la pobreza tuvo un incremento del 3.5% en el riesgo relativo de progresión de le enfermedad (menor tiempo en la duplicación del nivel de creatinina sérica) En otro estudio en New York el impacto de la pobreza mostró un sobrevida a 65 meses del 42% en pacientes pobres vs. 78%.

LES: Factores genéticos y moleculares Mayor predisposición en raza negra Incremento en la prevalencia del receptor gama FC 2A, Incremento en los títulos de (Ig) G2 especifica para C1q y disminución en la capacidad de aclaramiento de complejos inmunes circulantes posiblemente predispone a un mayor riesgo de daño renal.

Indice de Actividad NIH Máximo: 24 puntos Proliferación celular : 1-3 Infiltración leucocitaria (exudado) : 1-3 Necrosis fibrinoide (x 2) : 1-3 Proliferación extracapilar (x 2) : 1-3 Depósitos subendoteliales, trombos hialinos y asas de alambre : 1-3 Infiltrado intersticial : 1-3

Indice de Cronicidad NIH Máximo: 12 puntos Esclerosis glomerular : 1-3 Medias lunas esclerosadas : 1-3 Fibrosis intersticial : 1-3 Atrofia tubular : 1-3

Lupus Eritematoso Diseminado Indices de actividad y cronicidad Siempre deberá haber en el reporte información de los índices de actividad y cronicidad ( valor predictivo pronostico a largo termino). Búsqueda de estandarización para mejor reproducibilidad ínterobservador e intraobservador Ej: 1+ < 25%, 2+ a 25% -50%, y 3+ a > 50%. Los factores negativos de mayor importancia son la presencia de medialunas en mas del 30% de los glomérulos, un índice de cronicidad > 5, sexo masculino, y alta actividad glomerular

Recomendaciones para el informe de las biopsia renales en pacientes con LES Indicar la presencia y graduación (leve moderada o severa) de la atrofia tubular, nefritis intersticial o fibrosis. Indicar severidad de arteriosclerosis o presencia de lesiones vasculares . Indicar la proporción de glomérulos con lesiones activas y lesiones escleróticas. Indicar la proporción de glomérulos con necrosis fibrinoide o medias lunas activas Kidney Int. 2004, 65: 521-530

Hallazgos asociados a progresión* Proliferación Celular , PEC celular y fibrosis intersticial. 80% vs. 20 % a 40-50 meses Actividad de la enfermedad de > 1.73 80% vs. 15% a 4000 días Pesistencia de inflamación e IF(+) Cariorrexis: 75% vs. 26% Medias Lunas: 69% vs. 33% * Riesgo de progresión (doblaje de la creatinina sérica)

Valor de la ME en nefropatía por IgA Entidad que requiere siempre de la biopsia para su diagnóstico Por definición: Depósitos mesangiales de IgA En ocasiones los hallazgos de IF están ausentes ME: Soporte morfológico en casos difíciles Patologías sobreimpuestas Exclusión de otras condiciones: LES, Hepatitis, Cirrosis, Infecciones etc.

Valor de la ME en nefropatía por IgA Depósitos mesangiales o paramesangiales A lo largo de la MBC/M pequeños y elongados Grandes intramesangiales Tamaño 100-1000nm A veces sutiles y se pierden en mesangio En 40% Extramesangiales en subendotelio, IM o SEP: mayor agresividad, excluir LES aún si serología es negativa Microscopía de luz: Heterogénea: Nada, Nefropatía mesangial, GEFS GNRP Esclerosis glomerular

Valor de la ME en nefropatía por IgA Hipercelularidad e hipertrofia mesangial Fusión segmentaria de podocitos en casos de proteinuria asociada Si hay depósitos extraglomerulares: posiblemente no es IgA sino LES 10-15% asocia a MBD o a engrosamientos similares al Alport Segmentarios y no difusos Se asocian a peor pronóstico: Morita M, Sakaguchi H. A quantitative study of GBMchanges inIgA nephropathy. J Pathol. 1988;154:7: 18-49 Formas secundarias: Muy similares, en general depósitos de menor tamaño, localización extramesangial Nefropatía por IgA sin IgA: Julian BA, Cannon VR, Waldo FB, Egido J. Macroscopic hematuria and proteinuria preceding renal IgA deposition in patients with IgA nephropathy. Am J Kidney Dis.1991;17:472-479.

Valor de la ME en nefropatía por IgA Valor pronóstico Marcada expansión mesangial Grandes depósitos de complejos inmunes Presencia de fibrillas de colágeno Diferenciación en pacientes con proteinuria importante o nefrótica de cambios progresivos o enfermedad de la célula epitelial sobreimpuesta Anomalías de MBG Existe la nefropatía por IgA en pacientes con LES ? No es inusual verla en sobreposición a otras nefropatías

Valor de la ME en nefropatía por IgA Anomalías difusas de la MBG Nefropatía diabética incipiente; engrosamiento de MBC Glomerulonefritis aguda postinfecciosa Nefritis Intersticial Aguda

Serum IgA/C3 Ratio May Be a Useful Marker of Disease Activity in Severe Henoch-Schönlein Nephritis Jae Il Shina, Jee Min Parka, Youn Ho Shina, Jae Seung Leea, Hyeon Joo Jeongb, Hyon Suk Kimc Departments of Pediatrics Pathology, and Laboratory Medicine Institute of Kidney Disease, Yonsei University College of Medicine, Seoul, Korea To investigate whether the serum IgA/C3 ratio can be a serologic marker of disease activity in children with severe Henoch-Schonlein nephritis. Conclusion: These findings suggest that the serum IgA/C3 ratio may be a useful marker to predict disease activity and histologic severity in HSN...

Propuesta de los Patólogos: Definición de Nefropatía por IgA INTERNATIONAL IgA NEPHROPATHY NETWORK & RENAL PATHOLOGY SOCIETY In collaboration with the International Society of Nephrology CONSENSUS ON PATHOLOGY OF IgA NEPHROPATHY Propuesta de los Patólogos: Definición de Nefropatía por IgA En riñones nativos se define como la presencia en forma dominante o co-dominente de tinción para IgA en glomérulos por inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa No todos los glomérulos tienen que estar positivos. Nefritis lúpica o relacionadas deben excluirse La intensidad de la tinción para la IgA debe ser más que trazas. La distribución de la tinción debe incluir el mesangio con o sin reacción a nivel del asa capilar, excluyendo tinciones puramente membranosas difusas granulares, tinciones lineales. IgG e IgM pueden estar presentes pero nunca en mayor intensidad a la IgA, exceptuando IgM en zonas de esclerosis C3 puede estar presente, la presencia de C1q mas que trazas debe plantear la posibilidad de una nefropatía lúpica

Papel del podocito en la patología renal Estructura del diafragma Proteína Neph1: secuencia homologa a la Nefrina y se une a la podocina a nivel intracelular, son moléculas que envían señales que activan kinasas intracelulares Otras proteínas: CD2AP: mantenimiento del diafragma, Zona Ocludens-1 (ZO-1):Señales transmembranosas Cateninas, Alfa 4 actinina

Estructura del diafragma PODOCINA codificada por el gen NPH2 esencial para la estabilidad del complejo de otras dos proteínas la Neph1 y la CD2AP Mutaciones : Glomeruloesclerosis focal y segmentaria esporádica SN. corticoresistente

Glomeruloesclerosis focal y segmentaria GEFS es un patrón histopatológico que corresponde a muchas condiciones Si se asocia a Síndrome nefrótico muy posiblemente corresponde a una enfermedad difusa de la célula epitelial idiopática o primaria.

Focal Segmental Glomerulosclerosis in Nephrotic Adults: Presentation, Prognosis, and Response to Therapy of the Histologic Variants Micky J. Chun*, Stephen M. Korbet*, Melvin M. Schwartz and Edmund J. Lewis* J Am Soc Nephrol 15:2169-2177, 2004

Clasificación de la GEFS Morfológica Nos, perihiliar, apical, celular y colapsante Etiológica Primaria Secundaria Mutaciones (Actininja, Podocina, WT1 etc.) Virus: Parvovirus , VIH Drogas: heroína, Interferón, Pamidronato etc. Adaptativas ( Vasodilatación, aumento presión etc.) Cicatricial

“Glomerular tip lesion” o variante Apical Persistencia, progresión, respuesta esteroides Coexistencia con otras enfermedades GNM, IgA, Diabetes, GNPI, Transplante. 47/ 10,173 BX ( Renal Pathology Laboratory at Columbia Presbyterian Medical Center) Enero 1991 y Marzo 2003(0.46%). Exclusión: Colapsante

“Glomerular tip lesion” o variante Apical Hass y colbs: 5/8 autopsias en niños con NCM (Johns Hopkins Hospital ) Lesión siempre focal Casos difusos con hipercelularidad mesangial o con cambios focales de GEFS o lesiones perihiliares o indefinidos semejan más GEFS RC o RP en 72.4%(58% y 14%) Pacientes en espectro de NCM (RC75%)/GEFS (RC30%) Categoría favorable de GEFS

GEFS variante Colapsante Enfermedad de curso rápido, solo ocasionalmente se logra remisiones completas Hacer parte de una forma primaria idiopática Frecuentemente asociada a VIH Puede verse recurrente o de novo en transplante Secundaria a otra infección viral : Parvovirus ? Se acompaña frecuentemente de proteínas de reabsorción

GEFS variante Colapsante Cambios tubulares severos. No es inusual que se encuentre positividad en la Inmunofluorescencia por atrapamiento de Ig y Complemento ( IgG y C3 ) con ME negativa, sugiriendo atrapamiento. VIH : inclusiones túbulo-reticulares. Requiere solo un glomérulo con lesión.

GEFS variante Colapsante Fisiopatología Multiplicación celular ineficiente Producción de podocitos desdiferenciados Perdida forma, procesos y citoesqueleto Obstrucción de espacio de Bowman con penetración a túbulos “Lesion Celular” Colapso: perdida de células mesangiales y endoteliales

Determinación de factores pronósticos

Determinación de factores pronósticos Efecto de daño tubulointersticial progresivo Proteinuria Activación intraluminal de vías terminales del complemento C5b-9 F I B R O S Formación de complejos de ataque de membranas MAC Efectos sublíticos, inducción de citoquinas profibróticas, proinflamatorias y protrombóticas Acúmulos de miofibroblástos intesrticiales

Papel de Macrófagos en enfermedad renal Incremento en la excreción de proteínas Nefropatía por IgA GN membranosa GN membranoproliferativa GE focal y segmentaria Nefropatía diabética Nefritis tubulointerstitial con presencia de monocitos y linfocitos T

Metodologías de aplicación reciente en patología renal Hacia done vamos ?

Gene expression analysis of human renal biopsies: recent developments towards molecular diagnosis of kidney disease Anna Henger, Holger Schmid and Matthias Kretzler Curr Opin Nephrol Hypertens 2005,13:313–318.

Perfiles moleculares Cohen CD, Grone HJ, Grone EF, et al. Laser microdissection and gene expression analysis on formaldehyde-fixed archival tissue. Kidney Int 2002;61:125–132. Waga I, Yamamoto J, Sasai H, et al. Altered mRNA expression in renal biopsy tissue from patients with IgA nephropathy. Kidney Int 2003; 64:1253–1264. Sarwal M, Chua MS, Kambham N, et al. Molecular heterogeneity in acute renal allograft rejection identified by DNA microarray profiling. N Engl J Med, 2003; 349:125–138. Randhawa PS, Vats A, Zygmunt D, et al. Quantitation of viral DNA in renal allograft tissue from patients with BK virus nephropathy. Transplantation 2002; 74:485–488. Weissinger EM, Wittke S, Kaiser T, et al. Proteomic pattern in urine of patients with primary renal disease [abstract]. Nephrol Dial Transplant 2003; 18 (Suppl 4):642. (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo).

4 categorias- genes “upregulated” Heterogeneidad molecular en rechazo agudo identificado con estudios de microarreglos de ADN 4 categorias- genes “upregulated” AR-I: HLA, TCR, INFү, IgG, CD20 AR-II: TGFβ, VEGF, FGF; Complemento, Apoptosis, activación linfocitaria Infección/Toxicidad drogas: Normal Injuria Crónica AR-III: Ciclina B, Ciclina A”, CCCR5 Sarwal et al. N Engl J Med 2003, July, 349; 125-138

Microarreglos en transplante 4 categorias- genes con expresión Tres sub. grupos moleculares de rechazo agudo con pronóstico significativamente diferente. AR-I, : Pobre recuperación funcional, resistencia a esteroides, células T activadas. Presencia de señales relacionadas con células B CD20 (Más de 275 por HPF) se asocia a resistencia esteroidea y asocia con pérdida al injerto. AR-II Sobreposición AR-III células T en reposo, En general: predominio de CD8 sobre CD4, escasas, EBV negativo C4d + PCNA

Conclusiones El buen manejo de la muestra es indispensable para lograr el resultado esperado La biopsia renal es una herramienta importante (si no la mejor) para determinar el tipo de compromiso renal en enfermedades primarias y sistémicas al momento del diagnóstico y en el seguimiento de la enfermedad Debe en lo posible utilizarse todas las metodologías disponibles para el logro de un diagnóstico adecuado

Conclusiones El advenimiento de nuevas técnicas moleculares incluyendo los estudios de perfiles genéticos y proteómicos nos llevarán a un mejor entendimiento de los procesos patológicos y enriquecerán el estudio de la biopsia renal con de la aplicación de los marcadores inmunohistoquímicos.