IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS de interés médico TRABAJO PRÁCTICO N° 8 Natalia Peralta – Bioquímica Parasitología y Micología UNSL

Levaduras más frecuentemente asociadas a las infecciones sistémicas: Candida albicans Candida parapsilosis Candida tropicalis Candida glabrata Candida krusei Candida guilliermondii Cryptococcus neoformans Trichosporon spp.

Colonia cremosa de color blanco amarillento, lustrosa, poco elevada y de bordes bien definidos. Cuando se observa el desarrollo de una colonia sobre cualquiera de los tubos del primocultivo, se procede a identificar el aislamiento. El primer paso en el estudio de una levadura es la obtención de un cultivo puro a partir del cual se puedan iniciar los estudios sistemáticos de sus características morfológicas, fisiológicas y sexuales bajo condiciones estandarizadas.

La identificación puede variar desde unos pocos test simples, para identificación presuntiva de Cándida albicans y Cryptococcus neoformans a una gran variedad de pruebas necesarias para identificar a todas las levaduras comúnmente aisladas en los laboratorios de micología.

Pruebas para identificación de levaduras: 1- Prueba de formación de tubo germinativo por Candida albicans. 2- Prueba de formación de Clamidosporas por Candida albicans. 3- Agar semillas de girasol para diferenciación de Cryptococcus neoformans. 4- Prueba de la producción de ureasa para Cryptococcus neoformans. 5- Crecimiento a 28 º C y 37 º C. 6- Crecimiento en extracto de malta para estudio micromorfológico. 7- Cultivo en lámina en agar morfología (Difco) para estudio micromorfológico. 8- Crecimiento en agar morfología (Difco) para macromorfología. 9 - Ensayo de asimilación de Glucosa, Galactosa, L-Sorbosa, Celobiosa, Trehalosa, Sacarosa, Maltosa, Lactosa, Melibiosa, Rafinosa, Melezitosa, D- Xilosa, L-arabinosa, D-ribosa, D-manitol, ácido cítrico, eritritol y m-Inositol. 10 - Ensayo de asimilación de nitrato de potasio y peptona. 11 - Ensayo de fermentación de Glucosa, Sacarosa, Galactosa, Maltosa, Trehalosa y Lactosa. 12 - Crecimiento en medio libre de vitaminas. 13 - Producción de ascosporas.

Reactivos comerciales Permiten arribar a la identificación presuntiva: - Chromagar Candida - Chromagar ID Permiten la identificación confirmatoria: - ID 32C - Yeast Star - API 20C - Auxacolor - Vitek - RapID Yeast Plus system - Fungichrom

Algoritmo de identificación presuntiva

PRUEBAS PARA IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA DE LEVADURAS

Prueba de formación de tubo germinativo - Prueba más confiable para identificar presuntivamente a Candida albicans. - Procedimiento: Realizar suspensión ligera de un cultivo de 24 h de la cepa en estudio en 0,5 ml de suero bovino.

Tubo germinativo • El tubo germinal es una extensión filamentosa de la levadura, sin estrechamiento en su origen cuyo ancho suele ser la mitad de la célula progenitora y su longitud tres o cuatro veces mayor que la célula madre.

• Existe un 10% de falsos positivos y 10% de falsos negativos. • Influye la experiencia del operador.

La estructura A corresponde a un verdadero tubo germinativo La estructura B es un falso positivo

Observación de la Micromorfología - Se debe realizar siempre, ya sea para la identificación presuntiva como para la identificación completa. - Se puede realizar en EXTRACTO DE MALTA LÍQUIDO, para observación de las principales estructuras que caracterizan a la reproducción vegetativa.

- Se puede realizar en AGAR HARINA DE MAÍZ, que permite la observación de la disposición de las estructuras y además, en el caso de C. albicans, se puede ver la formación de clamidoconidias. C. albicans: Clamidosconidias y disposición de blastoconidias y pseudomicelio.

Siembra en un agar cromogénico - Especialmente CHROMagar Candida que permite identificar: C. albicans (verde) C. tropicalis (azul) C. krusei (rosa seca)

Prueba de ureasa (Agar urea de Christensen) - C. neoformans y otros Cryptococcus spp. e incluso otras levaduras producen ureasa. C. albicans y otras especies del género Candida no la producen. - El medio de urea que se usa contiene rojo de fenol, que vira al color rojo cuando se hidroliza la urea y se libera amonio alcalinizando el medio de cultivo.

Agar semillas de girasol - Para identificación de C. neoformans . - C. neoformans produce un pigmento marrón en el agar semillas de girasol a temperatura ambiente debido a la actividad fenoloxidasa localizada en la pared celular de este hongo. Ninguna otra especie de este Género, ni otras levaduras, poseen esta propiedad.

Prueba de asimilación de trehalosa - Para identificar presuntivamente a Candida glabrata, debido a que fermenta y asimila la trehalosa. Sin embargo, otras levaduras también fermentan la trehalosa, tal es el caso de Candida tropicalis, por tal motivo deberá basarse en la MICROMORFOLOGÍA para la utilización de esta prueba.

En reumen: Algorismo de identificación presuntiva de levaduras

PRUEBAS PARA IDENTIFICACIÓN DEFINITIVA DE LEVADURAS

Los métodos que existen actualmente en el mercado son los siguientes: ID 32C API 20C VITEK YBC system (bioMérieux-Vitek) VITEK 2 System Fungichrom Yeast Star Auxacolor RapID Yeast Plus system

Método más comúnmente usado. No pudieron ser identificadas: C.albicans, C.guilliermondii, C.neoformans, Rhodotorula spp y S.cerevisiae. Mejor identificación de cepas atípicas. Tira de plástico con 32 pocillos con diferente sustratos deshidratados. Lectura a las 48 hs (T° 30°C). Lectura visualmente . Crecimiento: Turbidez en el pocillo. Resultados: Biocódigo numérico de 8 dígitos que permite la identificación a través de un manual de códigos.

La identificación levaduras se basa en la presencia o ausencia de ciertas enzimas, que se visualiza mediante reacciones colorimétricas. La actividad enzimática se revela con: 1. Hidrólisis de sustratos cromogénicos. 2. Asimilación de sustratos naturales. 3. Oxidación de sustratos sintéticos (fenoloxidasa). Tira de plástico con 16 pocillos con los sustratos. Se prepara un inóculo y se siembran dos gotas en cada una de las celdas. Se incuba 24 o 48 horas a30ºC . Lectura: Cambio de color. Interpretación de resultados: a través de un sistema de códigos y utilización de una tabla.

MUCHAS GRACIAS