PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN BACTERIANA

Presentación del tema: "PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN BACTERIANA"— Transcripción de la presentación:

1 PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN BACTERIANA
QFB. Susana Guerra Martínez. MCCA. María Teresa Reyes Blanco. QFB. María Guadalupe Atilano Durán.

2 PRUEBAS BIOQUIMICAS Determinan la actividad metabólica de una cepa pura. Son empleadas principalmente la identificación y clasificación de bacterias y hongos.

3 E + S ES E + P PRUEBAS BIOQUICAS
Se pueden resumir en los siguientes puntos: Sustrato (contenido en el medio de cultivo) Enzima o vía metabólica (secretada o en el interior del microorganismo) Producto Revelador y/o indicador (aunque algunas no los emplean)

4 INOCULACIONES ESTRIA EN BISEL. ESTRIA EN BISEL Y PICADURA PICADURA
Citrato Fenilalanina desaminasa Bilis esculina ESTRIA EN BISEL Y PICADURA Triple Azucar Hierro Lisina Hierro Agar Agar Kligler PICADURA Movilidad Indol Ornitina AGITACIÓN Infusión Cerebro Corazón RM/VP Caldo Urea

5 CATALASA Agar nutritivo, de preferencia no agar Sangre (ya que puede dar falsos positivos) Sustrato: Peróxido de hidrógeno Enzima: Catalasa Revelador: Ninguno.

6 CATALASA Se utiliza principalmente para diferenciar entre los géneros:
Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y Staphylococcus (+) Bacillus (+) de Clostridium (-) El peróxido de hidrógeno, si se acumula, es tóxico para las bacterias porque produce su muerte. La enzima Catalasa puede descomponer el peróxido, esta descomposición involucra la reducción de hierro (que se encuentra en la enzima) y la re oxidación para liberar oxígeno.

7 EVITAR HACERLO DE UN AGAR DE SANGRE.
CATALASA PROCEDIMIENTO. Con una asa de inoculación, tomar el centro de una colonia pura de un cultivo de 18 a 24 horas y colocar sobre un portaobjeto de vidrio limpio. EVITAR HACERLO DE UN AGAR DE SANGRE. Se le agrega una gota de peróxido de hidrógeno al 30% NO SE DEBE DE INVERTIR EL ORDEN DEL PROCEDIMIENTO NI MEZCLAR CON EL ASAPORQUE PUEDEN OCURRIR FALSOS POSITIVOS NEGATIVO: No hay burbujeo. POSITIVO: Burbujeo

8 OXIDASA Cultivo de medio nutritivo (No utilizar medios con carbohidratos ya que puede dar falsos positivos) Sustrato: Compuesto reducido. Enzima: Oxidasa. Producto: Compuesto oxidado. Revelador: diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (TPD) al 1%.

9 OXIDASA PROCEDIMIENTO:
De un medio nutritivo seleccionar una colonia aislada y tomar con un aplicador de madera. Colocar la cepa en un papel filtro estéril o impregnado previamente con el reactivo de oxidasa, de lo contrario agregarle el reactivo revelador. POSITIVO: Cambio de coloración NEGATIVO: No hay cambio en la coloración.

10 OXIDASA Se basa en la producción bacteriana de una enzima oxidasa intracelular. Esta reacción se debe a un sistema de citocromo oxidasa que activa la oxidación del citocromo reducido por el oxígeno molecular, el que a su vez actúa como un aceptor de electrones en la fase terminal del sistema de transferencia de electrones.

11 CITRATO Medio de Citrato de Simmons Sustrato: Citrato de sodio.
Vía: Varias dependientes del pH del medio. Producto: Acetato formado en condiciones alcalinas y Acetoína y CO2 en condiciones ácidas. Indicador: Azul de bromotimol. (Verde a pH ácido) (Azul a pH alcalino)

12 CITRATO Un microorganismo que puede utilizar el citrato como única fuente de carbono también utiliza las sales de amonio del medio como única fuente de nitrógeno. La extracción de nitrógeno de las sales de amonio producen amoniaco y se alcaliniza el medio virando el indicador al alcalino. Sin embargo hay microorganismos que solamente utilizan el citrato, por lo que solo se ve crecimiento.

13 CITRATO PROCEDIMIENTO:
Seleccionar una colonia y tocar el centro con una asa de inoculación. Sembrar en la superficie del bisel del medio de cultivo. Incubar a 37°C durante 18 a 72 horas. AUNQUE NO HAYA VIRAJE EN EL COLOR DEL MEDIO, SI HAY CRECIMIENTO EN EL BISEL, LA PRUEBA SE CONSIDERA POSITIVA. POSITIVO: Viraje a color azul o crecimiento en bisel. NEGATIVO: no hay viraje ni crecimiento.

14 COAGULASA Plasma de conejo Sustrato: Factores de la coagulación.
Enzima: Coagulasa. Producto: Coagulo. Revelador: No requiere. Universidad Central de Venezuela. Facultad de Farmacia

15 COAGULASA Inocular por agitación un caldo de Infusión Cerebro Corazón, una colonia aislada de un cultivo puro. Incubar a 37°C y revisar periódicamente. Revisar los resultados a las 4 o 24 horas después de la incubación. PARA EVITAR QUE HAYA INTERFERENCIA (FALSOS POSITIVOS) POR EL ANTICOAGULANTE CITRATO, SE RECOMIENDA UTILIZAR PLASMA EN EL CUAL SE HA UTILIZADO EDTA COMO ANTICOAGULANTE.

16 COAGULASA La enzima producida por S. aureus es excretada al medio extracelular, el mecanismo propuesto es la acción de esta enzima sobre los factores de la coagulación presentes en el plasma y formar un coagulo visible.

17 HIDROLISIS DE BILIS Y ESCULINA
Agar de Bilis y esculina. Sustrato: Esculina. Enzima: Esculinasa Productos: Esculetina + Sal de hierro = compuesto fenólico de color castaño oscuro o negro Indicador: citrato férrico y citrato de amonio (50/50) Revelador: No requiere

18 HIDROLISIS DE BILIS Y ESCULINA
Para que la hidrolisis se lleve a cabo, tienen que haber dos procesos: Crecer en presencia de bilis. Estreptococos del grupo D que hidrolizan la esculina, son inhibidos por la bilis. La bilis también inhibe a los Gram positivos. 2. Producir esculinasa (enzima que hidroliza la esculina). POSITIVO: Color castaño oscuro a negro en el pico de flauta o ennegrecimiento del medio si es en placa. NEGATIVO: No hay ennegrecimiento del medio. Crecimiento en el medio, ya que eso solo significa que la bilis no los inhibió.

19 HIDROLISIS DE BILIS Y ESCULINA
En esta prueba se revisa la capacidad de hidrolizar el glucósido esculina a esculetina y glucosa en presencia de bilis. Sirve para poder hacer la Identificación y diferenciación de Enterococcus del grupo D y Streprococcus del grupo D, de otros que no pertenecen a este grupo.

20 SOLUBILIDAD EN BILIS PRINCIPIO. Detectar la capacidad de las células bacterianas para producir lisis en presencia de sales biliares. Las sales biliares utilizadas son el desoxicolato de sodio y el taurocolato de sodio. Que aceleran el proceso autolítico del neumococo. Streptococcus pneumoniae, es soluble en la bilis, y puede diferenciar otras especies de Streprococcus alfa hemolíticos. Se prepara una solución al 2% de la sal biliar y se coloca sobre la colonia para observar liquefacción.

21 DESCARBOXILASAS Medio base de descarboxilasas u otros medios como LIA o MIO. Sustrato: Aminoácidos (lisina, ornitina o arginina). Enzimas: Descarboxilasas. Producto: Amoníaco. Indicador: Púrpura de bromocresol. TODA DESCARBOXILACIÓN DE LISINA DEBE LLEVARSE A CABO EN MEDIO ÁCIDO, POR LO TANTO ES NECESARIO QUE PRIMERO SE FERMENTE LA GLUCOSA

22 DESCARBOXILASAS LISINA HIERRO AGAR.
Seleccionar una colonia de un agar nutritivo o enriquecido de un cultivo puro. Tocar con el asa el centro de dicha colonia y realizar la siembra mediante picadura y estria en el bisel. Incubar a 37°C durante 18 a 24 horas. MOVILIDAD INDOL ORNITINA. Seleccionar una colonia de un agar nutritivo o enriquecido de un cultivo puro. Tocar con el asa el centro de dicha colonia y realizar la siembra mediante picadura en el centro del medio de cultivo. Incubar a 37°C durante 18 a 24 horas.

23 LISINA HIERRO AGAR

24 LISINA HIERRO AGAR Se basa en la descarboxilación o desaminación de la lisina y la producción de ácido sulfhídrico. FUNDAMENTO Peptona como nutrientes. Glucosa es el carbohidrato. Lisina es el sustrato para detectar las enzimas descarboxilasa o desaminasa. Sales de hierro para producción de ácido sulfhidrico El púrpura de bromocresol es el indicador AMARILLO pH <5.4 VIOLETA pH <6.8 DESCARBOXILACIÓN: cadaverina, alcaliniza el medio y vira a morado.

25 LISINA HIERRO AGAR La descarboxilación se observa cuando todo el medio vira a morado. Debido a que la perdida del grupo carboxilo, da productos alcalinos. Cuando la descarboxilación es negativa, hay parte del medio que queda color amarillo (acidificado). La desaminación se produce ácido alfa-ceto-carbónico, el cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxígeno forma un color rojizo en la superficie del medio.

26 MOVILIDAD INDOL ORNITINA
La Movilidad se observa en los medios semisólidos, cuando inoculamos por picadura, se puede ver si crece solo en la zona de la picadura (inmóvil) o si se extiende y difunde por el medio, observándose turbidez (móvil) La Ornitina se lee con la coloración del medio de cultivo. Al igual que la lisina el medio de cultivo se alcaliniza cuando hay una descarboxilación. Observandose de un color morado por el púrpura de bromocresol. El Indol es la prueba que se recomienda leer al final, ya que como reactivo revelador se utiliza el reactivo de Kovac o de Erlich. Se colocan 4 gotas del reactivo al medio para poder observar el cambio de coloración. HALO ROJO EN LA SUPERFICIE: POSITIVO. HALO AMARILLO EN LA SUPERFICIE: NEGATIVO.

27 INDOL La prueba de la izquierda es negativa, la de la derecha es positiva.

28 Prueba de Indol positiva.

29 KLIGLER Sustratos: Glucosa 0.1%, lactosa 1% y Tiosulfato o grupos –SH de la cisteína. Vía: Fermentativa y Enzimas: Tiosulfato reductasa y cisteína desulfurilasa. Productos: Ácidos mixtos y H 2S. Indicadores: Rojo de fenol y sales de Fe2+ .

30 KLIGLER Las bacterias incapaces de fermentar utilizan las peptonas y liberan aminas que alcalinizan todo el medio. Las bacterias que solo fermentan la glucosa, inicialmente también utilizan aeróbicamente la glucosa. Debido a la baja concentración de glucosa (0.1%), metabolizan las peptonas alcalinizando la superficie del medio. Las bacterias fermentadoras de glucosa y lactosa, fermentan la glucosa 0.1% y al término de esta, fermentan la lactosa 1%, permitiendo la acidificación completa del medio.

31 TRIPLE AZUCAR HIERRO Tres pruebas:
Fermentación de carbohidratos: Glucosa, lactosa, sacarosa. Producción de gas a partir de la glucosa. Producción de ácido sulfhídrico a partir de la glucosa.

32 TRIPLE AZUCAR HIERRO – FERMENTACIÓN
Cuando no hay fermentación de ningún carbohidrato, se observa el tuvo rojo, al contrario, la utilización de las peptonas hace que el medio se haga de un color rojo mas intenso. La fermentación de los tres carbohidratos, se evidencia cuando todo el medio se hace amarillo por la acidez que provoca este metabolismo. Cuando solo se fermenta la glucosa, el medio se acidifica, pero el pico de flauta se torna rojo nuevamente debido a la alcalinización de las peptonas.

33 TSI. Producción de gas y H2S
La producción de gas y H2S se lleva a cabo a partir de la glucosa, va de la mano con el resultado de fermentación. El gas se observa con una burbuja en el fondo del tubo o a través de la picadura, y el H2S, con un precipitado negro formado por las sales de hierro.

34 TRIPLE AZUCAR HIERRO En presencia de tiosulfato en el medio o la degradación de proteínas liberando aminoácidos azufrados, algunos microorganismos forman H2S gaseoso por medio de las enzimas tiosulfato reductasa y cisteína desulfurilasa. El gas incoloro H2S se forma en condiciones ácidas y reacciona con el citrato de amonio férrico para producir un precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso metálico.

35 ROJO DE METILO/ VOGES PROSKAUER
Caldo RM/VP Sustrato: Glucosa. Vías: Fermentación ácida/ Neutra. Producto: Acido orgánicos/Acetoína. Reveladores: Solución de Rojo de Metilo/ Alfa Naftol y KOH 40%

36 ROJO DE METILO/ VOGES PROSKAUER
FERMENTACIÓN ÁCIDO MIXTA. Los productos finales son ácidos orgánicos que provocan un descenso brusco del pH inicial del medio. (ROJO DE METILO) Mayor a 5.1 vira a amarillo. Menor al 4.4 vira a rojo. FERMENTACIÓN BUTILENGLICÓLICA. En esta parte se metaboliza produciendo cantidades menores de ácido láctico, produciendo productos neutros también. (VOGUES PROSKAUER)

37 ROJO DE METILO/ VOGES PROSKAUER REVELADORES
Reactivo de Rojo de Metilo. Ambos caldos deben de inocularse mediante agitación con una asa, tomando una colonia aislada. Se incuban a 37°C por 24 horas. Y se les adicionan los reactivos después. VOGES PROSKAUER -naftol 5% KOH al 40%

38 FENILALAINA Sustrato: Fenilalanina Enzima: Fenilalanina desaminasa
Producto: Ácido fenipirúvico. Revelador: Cloruro férrico al 10%

39 FENILALANINA Determina la capacidad de un microorganismo para desaminar la fenilalanina a ácido fenilpirúvico por vía enzimática, con la producción de acidez. PROCEDIMIENTO: Inocular el medio de fenilalanina en el bisel con una colonia aislada. Incubar a 37°C durante 24 a 48 horas. Sacar de la incubadora y agregar cuatro gotas de Cloruro férrico al 10%, cubrir la superficie del bisel con el reactivo. Observar si hay cambio de coloración. Verde: positivo (debido a la formación del cetoácido).

40 UREA Caldo urea o agar urea de Cristensen. Sustrato: Urea.
Enzima: Ureasa. Producto: Amoníaco. Indicador: Rojo de fenol.

41 UREA La hidrólisis de la urea por la enzima ureasa libera dos moléculas de amoniaco que alcaliniza el medio, entonces se vira el indicador de pH, en el caso del rojo de fenol una prueba positiva es color bugambilia.

42 NOVOBIOCINA Determinación de la sensibilidad de un microorganismo a la Novobiocina. OBJETIVO: Diferenciación presuntiva entre cocos grampositivos, catalasa positivos. Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus saprophyticus

43 NOVOBIOCINA PROCEDIMIENTO.
Seleccionar 3-4 colonias puras de estreptococos beta hemolíticos. Con asa bacteriológica o hisopo estéril, estriar la mitad de la caja para obtener una siembra uniforme. Colocar un disco de taxo NB. Y con unas pinzas flameadas presionar el disco suavemente para que se adhiera al agar. Incubar las placas de modo invertido por 18 a 24 horas a 35°C. Cualquier zona de inhibición en el medio de cultivo, alrededor del disco, se considera como susceptible.

44 Resistencia y Susceptibilidad a la Novobiocina

45 BACITRACINA PRINCIPIO. Determinación de la sensibilidad de un microorganismo a la bacitracina. OBJETIVO. Diferenciación presuntiva entre estreptococos Beta hemolíticos del grupo A, de otros Beta hemolíticos. LA BACITRACINA ES UN ANTIBIOTICO BACTERICIDA INHIBIDOR DE LA SINTESIS DE LA PARED CELULAR

46 BACITRACINA TAXO A. Se utilizan medios de cultivo NO SELECTIVOS, como Agar Sangre de Carnero. PROCEDIMIENTO. Seleccionar 3-4 colonias puras de estreptococos beta hemolíticos. Con asa bacteriológica o hisopo estéril, estriar la mitad de la caja para obtener una siembra uniforme. Colocar un disco de taxo A. Y con unas pinzas flameadas presionar el disco suavemente para que se adhiera al agar. Incubar las placas de modo invertido por 18 a 24 horas a 35°C con una atmósfera del 5 al 10% de C02.

47 BACITRACINA INTERPRETACIÓN Sensible (S): Streptococcus pyogenes.
Resistente (R): Streptococcus agalactiae grupo B Cualquier zona alrededor del disco, es crecimiento inhibido.

48 OPTOQUINA La optoquina es un antibiotico utilizado para observer la susceptibilidad o Resistencia por parte de cocos grampositivos. Para Streptococcus pneumoniae es una de las pruebas básicas para el diagnóstico, siendo susceptible a éste antibiótico. La inoculación de la muestra debe realizarse con un standard de McFarland ajustado a 0.5.

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50 REFERENCIAS Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica. Jean F. MacFaddin. Ed. Médica Panamericana, 2003 UK Standards for Microbiology Investigations Manual de pruebas bioquimicas. UNAM.