DESARROLLO DE UNA TÉCNICA PARA EL ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD IN VITRO A ANFOTERICINA B MEDIANTE CITOMETRÍA DE FLUJO MULTIPARAMÉTRICA Lourdes Cordón – Servicio.

DESARROLLO DE UNA TÉCNICA PARA EL ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD IN VITRO A ANFOTERICINA B MEDIANTE CITOMETRÍA DE FLUJO MULTIPARAMÉTRICA Lourdes Cordón – Servicio de Hematología y Hemoterapia Hospital Universitario La Fe 22 de abril de 2010

DESARROLLO DE UNA TÉCNICA PARA EL ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD IN VITRO A ANFOTERICINA B (AMB) MEDIANTE CITOMETRÍA DE FLUJO MULTIPARAMÉTRICA Introducción - Proyecto - Antecedentes Objetivo Material y métodos Resultados - Puesta a punto de la técnica - Actividad sobre Candida spp - C. albicans - C. parapsilosis - Otras especies de Candida Conclusiones

INTRODUCCIÓN - PROYECTO -
Estudio Colaborativo: Hematología – Microbiología Experimental Financiación con Fondos Privados Autorización por la Fundación para la Investigación Hospital Universitario La Fe (Grupo MICELIUM, Proyecto nº 2010/004) Equipamiento: CMF FACSCalibur (Becton Dickinson) Investigadores: Dr. Javier Pemán Dr. Isidro Jarque Dra. Amparo Sempere Dra. Emilia Cantón Eva González Lourdes Cordón

INTRODUCCIÓN - ANTECEDENTES -
Aumento de la incidencia de infecciones fúngicas invasoras Infecciones oportunistas por Candida spp: elevada morbi-mortalidad en pacientes inmunodeprimidos Prevalencia variable Anfotericina B: AF de referencia

- Métodos estandarizados para estudio de sensibilidad in vitro a los antifúngicos (1, 2) Escasa precisión en la detección de resistencia a AMB Limitado crecimiento de algunos organismos Lectura visual imprecisa en ocasiones Larga duración de la técnica: 24–48 horas (1) Subcommittee on Antifungal Susceptibility Testing (ASFT) of the ESCMID European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST), EUCAST Definitive Document E.DEF 7.1. Method for the determination of broth dilution of antifungal agents for fermentative yeasts. Clin. Microb. Infect. 14: (2008) (2) Clinical and Laboratory Standards Institute. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts, Approved Standard. CLSI Document M27-A3. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA, USA (2008)

CRECIENTE INCIDENCIA INFECCIONES FÚNGICAS INVASORAS INTRODUCCIÓN NUEVOS ANTIFÚNGICOS NO SON PRÁCTICAS SON LABORIOSAS Y LARGAS TÉCNICAS DE REFERENCIA CMF

Detección hongos en cultivo Características morfométricas Marcadores específicos viabilidad y actividad

La Citometría de Flujo Aplicada al Estudio de la Sensibilidad in vitro a los Antifúngicos Ventajas Mayor objetividad y sensibilidad Análisis multiparamétrico individual de gran número de microorganismos Disminución de los periodos de incubación Rápida evaluación del patrón de sensibilidad antifúngica Desventajas Elevado coste de equipos Operadores experimentados Escasa disponibilidad de fluorocromos

OBJETIVO Desarrollo de una técnica rápida para el estudio in vitro de la sensibilidad a los antifúngicos utilizando la citometría de flujo como alternativa a los métodos de microdilución estandarizados y comercializados en la actualidad

ACTIVAS METABÓLICAMENTE
MATERIAL Y MÉTODOS FLUOROCROMO λ ex (nm) λ em (máx) (nm) CÉLULAS MARCADAS NARANJA DE TIAZOL (NT) 488 533 TODAS YODURO DE PROPIDIO (IP) 630 NO VIABLES FUN®-1 588 ACTIVAS METABÓLICAMENTE

INTERVALOS DE CMI (µg/mL) DE AMB
MATERIAL Y MÉTODOS CEPA / AISLADO CLÍNICO INTERVALOS DE CMI (µg/mL) DE AMB C. albicans CA-365 0,5 – 1 C. albicans CA-354 0,12 – 0,25 C. albicans CA-361 C. parapsilosis ATCC-22019 0,25 – 2 C. krusei ATCC-6258 0,5 – 2 C. albicans ATCC 1 – 2 Conservación en suspensión en suero salino a T.A. Dos pases en agar Sabouraud dextrosa (SDA, Bionica S.L., España) previo al procesamiento para estimular el crecimiento

MATERIAL Y MÉTODOS PREPARACIÓN SUSPENSIÓN LEVADURAS
Colonias en SS a D.O. 0,5 Mc. Farland (5x106 ufc/mL) 1/10 Diluciones 1/10 1/102 1/103 1/104 1/105 5x105 ufc/mL en RPMI VIVAS Autoclave 121ºC 10 min MUERTAS PREPARACIÓN ANFOTERICINA B Diluciones seriadas 1/100 [AMB] 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25; 0,125; 0 μg/mL 10000 μg/mL 100 μg/mL

Resuspensión pellet en H2O
MATERIAL Y MÉTODOS PREPARACIÓN MUESTRAS CMF 2 mL diluciones AMB + 2 mL suspensión levaduras 35,5 ºC agitación suave 500 μL cada [AMB] con levaduras + + NT + IP: 5; 2,5; 1 o 0,20 μL (5 min, T.A.) FUN-1: 10; 5 o 2,5 μL (30 min, 35,5 ºC) Lavado a 3000g 10 minutos Resuspensión pellet en H2O Adquisición a 0, 2, 4, 6, 8 y 22 horas Adquisición a intervalos entre 30 min y 2 horas durante un máximo de 6 horas

MATERIAL Y MÉTODOS CALIBRACIÓN CMF ADQUISICIÓN DE MUESTRAS
FACSCalibur (Becton Dickinson) Calibración específica fluorocromo SSC y FSC: log, umbral: SSC ADQUISICIÓN DE MUESTRAS CellQuest Pro (Becton Dickinson) Velocidad media / alta 10000 eventos en región de células por SSC/FSC Limpieza con CONTRAD ANÁLISIS DE DATOS InfiniCyt (Cytognos): estrategia de análisis secuencial

MATERIAL Y MÉTODOS LECTURA VISUAL
- Suspensiones de levaduras con antifúngico a 35 ºC - Lectura visual de los tubos a las 24 y a las 48 horas - Comparación de la turbidez del tubo control sin AMB con el resto de tubos con concentraciones crecientes de AMB - CMI (CLSI): concentración más baja de AMB que inhibía por completo el crecimiento (no turbidez)

RESULTADOS - PUESTA A PUNTO DE LA TÉCNICA -
PREPARACIÓN DEL CMF C. albicans (NT + IP) C. albicans vivas C. parapsilosis vivas C. albicans (FUN-1) C. albicans muertas C. parapsilosis muertas

CONCENTRACIÓN DEL INÓCULO 5x106 ufc/mL en RPMI + DILUCIONES SERIADAS 1/10, 1/102, 1/103, 1/104, 1/105 CÉLULAS VIVAS CÉLULAS MUERTAS NT + IP FUN-1 NT + IP FUN-1 5X105 ufc/mL: - Adecuada tasa de eventos - Buena discriminación

VOLUMEN DE LOS FLUOROCROMOS NT + IP: 5, 2,5, 1 o 0,20 μL 0,20 μL FUN-1: 10, 5 o 2,5 μL 2,5 μL - Discriminación de poblaciones celulares - No producía ruido de fondo - Ahorro de reactivo

SENSIBILIDAD A AMB MEDIANTE CMF C. parapsilosis ATCC-22019 AMB 0 μg/mL T=0 hs AMB 0 μg/mL T=0 hs AMB 8 μg/mL T=22 hs AMB 8 μg/mL T=22 hs AMB 0 μg/mL T=0 hs AMB 8 μg/mL T=2 hs AMB 8 μg/mL T=2 hs AMB 0 μg/mL T=0 hs

Cepa/Aislado clínico Marcador [AMB]ACTIVA (μg/mL) T (min) LECTURA (24 hs) (μg/mL) CMI (CLSI) (μg/mL) C. parapsilosis ATCC-22019 NT + IP 1 >480 ND 0,25 – 2 C. krusei ATCC-6258 >120 0,5 – 2 C. albicans CA-354 0,5 0,125 0,12 – 0,25 C. albicans CA-361 FUN-1 30 0,25 0,5 – 1 C. albicans CA-365 C. albicans ATCC >8 1 – 2 0,25 – 1 >140 >230

RESULTADOS - ACTIVIDAD SOBRE Candida spp -
Candida albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. glabrata AMB: 0,03125 – 8 μg/mL FUN-1 (actividad metabólica) Células no lavadas Lectura turbidez a 24 y 48 horas CMI (CMF): concentración más baja de AMB que, en el menor tiempo, disminuye la actividad metabólica por debajo de un 80%

RESULTADOS - ACTIVIDAD SOBRE Candida albicans -
CMI (CMF): 0,125 μg/mL AMB (T=60 minutos)

RESULTADOS - ACTIVIDAD SOBRE Candida albicans -
AISLADO CMI (CMF) CMI 24 hs (CLSI) CMI 48 hs (CLSI) C. albicans CA-369 0,125 NV C. albicans CA-368 0,0625 0,25 C. albicans CA-367 C. albicans CA-364 0,03125 C. albicans CA-362 >2 C. albicans CA-361 C. albicans CA-363 C. albicans CA-360 C. albicans CA-359 C. albicans CA-358 0,5 C. albicans CA-357

RESULTADOS - ACTIVIDAD SOBRE Candida parapsilosis -

RESULTADOS - ACTIVIDAD SOBRE Candida parapsilosis -
AISLADO CMI (CMF) CMI 24 hs (CLSI) CMI 48 hs (CLSI) C. parapsilosis CP-406 0,125 NV C. parapsilosis CP-405 C. parapsilosis CP-404 C. parapsilosis CP-403 C. parapsilosis CP-401 0,25 C. parapsilosis CP-400 C. parapsilosis CP-399 0,0625 C. parapsilosis CP-398 C. parapsilosis CP-397 0,03125 C. parapsilosis CP-396

RESULTADOS - ACTIVIDAD SOBRE OTRAS ESPECIES DE Candida -

AISLADO CMI (CMF) CMI 24 hs (CLSI) CMI 48 hs (CLSI) C. tropicalis CT-068 0,03125 0,125 0,25 C. glabrata CG-056 C. glabrata CG-054 C. glabrata CG-053 ATCC-22019 2 ATCC-6258 0,5

CONCLUSIONES (I) La CMF permite discriminar células levaduriformes del ruido de fondo, principalmente causado por la AMB Los lavados de las células disminuyen significativamente este ruido de fondo, pero no parecen mejorar los resultados finales y prolongan la duración de la técnica La concentración del inóculo que proporciona mejores resultados es 5x105 ufc/mL En el estudio de sensibilidad a AMB por CMF se observa un descenso de la población de células viables proporcional al tiempo de incubación y a la concentración de antifúngico El FUN-1 permite obtener resultados más rápidos que NT + IP

CONCLUSIONES (II) Los datos obtenidos mediante CMF son equiparables a los intervalos de CMI para las cepas ensayadas, pero se requieren más ensayos para confirmar estos resultados preliminares Los resultados obtenidos con CMF son 2-3 diluciones más bajos que los obtenidos con el método de referencia Se observa una idiosincrasia en el comportamiento por CMF especie-dependiente, similar a la observada por el método de referencia No se ha observado ninguna discrepancia de categorización entre ambos métodos

CONCLUSIONES (II) Esta técnica debe adaptarse según la especie intentando estandarizar la metodología, debiendo ser fácil y reproducible para su incorporación en la rutina diagnóstica En el futuro está previsto validar la técnica para otras especies fúngicas, analizar otros antifúngicos (Candinas y Azoles) y estudiar la sensibilidad directamente en muestras de sangre periférica de pacientes con infección fúngica

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