PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA ENTEROBACTERIAS Microbiologia básica de Fonley J. Edit panamericana 2013

IDENTIFICACIÓN MICROBIANA Se entiende por identificación microbiana al conjunto de técnicas y procedimientos que se aplican para establecer la identidad de un microorganismo.

MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN BACTERIANA Los métodos más utilizados para la identificación microbiana, los podemos clasificar en: 1. Métodos basados en criterios morfológicos 2. Métodos basados en tinción diferencial 3. Métodos basados en pruebas bioquímicas 4. Métodos basados en tipificación con fagos 5. Métodos basados en pruebas serológicas 6. Métodos basados en detección molecular

En la mayoría de los casos la identificación no se realiza con base a un solo método, sino a la combinación de más de uno.

MÉTODOS BASADOS EN CRITERIOS MORFOLÓGICOS Los rasgos morfológicos han ayudado a los taxonomistas por muchos años a clasificar organismos. Los organismos superiores tienen rasgos anatómicos tan diferentes que pueden ser fácilmente utilizados en su clasificación, pero con respecto a los microorganismos, éstos lucen bajo el microscopio tan similares que se dificulta su clasificación.

Sin embargo, aun cuando la morfología celular dice poco sobre las relaciones filogenéticas, sigue siendo útil para la identificación bacteriana. Por ejemplo: la presencia de endosporas y su localización resulta de mucha utilidad en la identificación de bacilos esporulados.

MÉTODOS BASADOS EN TINCIÓN DIFERENCIAL La mayor parte de las bacterias, teñidas con Gram, las podemos clasificar como gram positivas o gram negativas, otras tinciones diferenciales, como la ácido resistente, se aplican a otro tipo de bacterias. Un examen microscópico de una lámina teñida por medio de gram o de una tinción diferencial es útil para obtener una información rápida sobre la calidad de un ambiente clínico.

MÉTODOS BASADOS EN TIPIFICACIÓN CON FAGOS La interacción entre un virus bacteriofago (fago) y su célula bacteriana sensible es sumamente específica, ya que el proceso de adsorción se encuentra mediado por receptores específicos tanto en el virus como en la célula bacteriana.

El uso de fagos específicos permite identificar y subclasificar bacterias dentro de una misma especie.

MÉTODOS BASADOS EN ENSAYOS SEROLÓGICOS Los métodos serológicos, implican la utilización de preparaciones de inmunoglobulinas específicas provenientes del suero o de un reactivo, y que pueden ser de gran utilidad en la identificación microbiana en muestras puras o en muestras biológicas.

MÉTODOS BASADOS EN BIOLOGÍA MOLECULAR Modernamente adquiere más importancia el uso de métodos basados en biología molecular donde, a través de procedimientos y reactivos, se pueden detectar determinadas secuencias de ADN que son propias de un determinado agente microbiano.

MÉTODOS BASADOS EN PRUEBAS BIOQUÍMICAS Las pruebas bioquímicas han sido ampliamente utilizadas para diferenciar bacterias. Estas pruebas se fundamentan en demostrar si el microorganismo es capaz de fermentar azúcares, la presencia de enzimas, la degradación de compuestos, la producción de compuestos coloreados, etc.

Aun bacterias fuertemente relacionadas pueden separarse en dos especies diferentes con base a pruebas bioquímicas. Por ejemplo, las bacterias entéricas gram negativas, forman un grupo muy grande y heterogéneo cuyo hábitat natural es el tracto gastrointestinal de humanos y otros animales. Esta familia, Enterobacteriaceae, incluye a varios patógenos que causan síndromes diarreicos.

ENTEROBACTERIAS Existen flujogramas, para la identificación bacteriana, mediante pruebas bioquímicas de microorganismos. Por ejemplo, la presencia de un coco bacilo gram negativo, facultativo, fermentador de glucosa, oxidasa negativo, nos indica la presencia de una enterobacteria, para determinar su género podemos seguir el siguiente esquema.

PRUEBAS BIOQUÍMICAS Citrato Ureasa Voges-Proskauer Rojo de metilo Sulfuro Indol Movilidad (SIM) Movilida, Indol, Ornitina (MIO) Triple azúcar Herro (TSI) Agar Lisina Hierro (LIA)

COLOR: VERDE INDICADOR: AZUL DE BROMOCRESOL SUSTRATO PRINCIPAL: CITRATO DE SODIO

PRINCIPIO Es una sal del acido cítrico. Algunas bacterias pueden obtener energía de fuentes distintas de la fermentación de los hidratos de carbono, con el citrato como única fuente de carbono. La medición de esta característica es importante para identificar muchos miembros de la familia Enterobacteriaceae. Cualquier medio usado para detectar la utilización del citrato por las bacterias que se van a probar debe carecer de proteínas e hidratos de carbono como fuente de carbono.

La utilización del citrato por la bacteria que se va a probar se detecta en el medio de citrato por la producción de subproductos alcalinos.

El medio contiene citrato de sodio, que es un anión, como única fuente de carbono, y fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno. Las bacterias que pueden utilizar el citrato también pueden extraer nitrógeno de la sal de amonio, con producción de amoniaco (NH+), lo que produce la alcalinización del medio por conversión del NH a hidróxido de amonio (NH 4 OH).

El indicador es el azul de bromotimol, que es amarillo por debajo de pH 6 y azul por encima de pH 7,6.

MEDIO DE CULTIVO El medio para citrato utilizado con mayor frecuencia es la formula de Simmons. El medio se coloca en tubos inclinados (agar en pico de flauta).

La formula del medio de citrato de Simmons es la siguiente: Fosfato de amonio dihidrogenado 1 g Fosfato dipotasico 1 g Cloruro de sodio 5 g Citrato de sodio 2 g Sulfato de magnesio 0,20 g Agar 15 g Azul de bromotimol 0,08 g Agua destilada 1 L pH final = 6,9

PROCEDIMIENTO Se toma una colonia bien aislada de la superficie de un medio de aislamiento primario y se siembra en forma de estría única en el pico de flauta (agar inclinado) del tubo de agar citrato. El tubo se incuba a 35 °C durante 24 a 48 horas.

RESULTADOS La prueba positiva esta representada por la producción de color azul oscuro en el termino de 24 a 48 horas, que indica que el microorganismo en prueba ha sido capaz de utilizar el citrato contenido en el medio, con formación de productos alcalinos.

La prueba también puede considerarse positiva sin que haya color azul, si hay desarrollo visible en la estría de siembra. Esto es valido porque para que el desarrollo sea visible, el microorganismo debió haber ingresado en la fase logarítmica de crecimiento, lo que solo es posible si ha asimilado carbono y nitrógeno.

Microorganismos Positivos Salmonella Arizona Citrobacter Enterobacter Klebsiella Serratia licuefaciensis Pseudomonas cepacia Microorganismos Negativos Edwarsiella Yersinia enterocolítica Escherichia coli Shigella Yersinia pseudotuberculosis Otras especies de Moraxella Proteus morganii

COLOR: ROSADO INDICADOR: ROJO FENOL SUSTRATO PRINCIPAL: URE A

PRINCIPIO Es una diamida del acido carbónico Todas las amidas se hidrolizan fácilmente, con liberación de amoniaco y dióxido de carbono. El amoniaco reacciona en solución para formar carbonato de amonio, lo que produce alcalinización y aumento de pH del medio.

MEDIOS DE CULTIVO Los dos medios utilizados con mayor frecuencia son el caldo urea de Stuart y el agar urea de Christensen. CALDO UREA DE STUART AGAR UREA DE CHRISTENSEN Extracto de levadura 0,1 g Peptona 1 9 Fosfato monopotasico 9,1 g Glucosa 1 g Fosfato disodico 9,5 g Cloruro de sodio 5 g Urea 20 g Fosfato monopotasico 2 g Rojo fenol 0,01 g Urea 20 g Agua destilada 1 L Rojo fenol 0,012 g Agar 15 g Agua destilada 1 L pH final = 6,8

PROCEDIMIENTO El medio liquido se siembra con un ansa de cultivo puro del microorganismo por probar. La superficie inclinada del agar (pico de flauta) se siembra en estría con el microorganismo por probar. Ambos medios se incuban a 35 °C durante 18 a 24 horas.

RESULTADOS Los microorganismos que hidrolizan la urea rápidamente pueden producir reacciones positivas en l o 2 horas; las especies menos activas pueden requerir 3 días o mas. Las reacciones son las siguientes:

1.Caldo de Stuart: Un color rojo en todo el medio indica alcalinización e hidrolisis de la urea.

2. Agar de Christensen: Degradadores rápidos de la urea (especies de Proteus): color rojo en todo el medio. Degradadores lentos de la urea (especies de Klebsiella): inicialmente color rojo solo en el pico de flauta, que gradualmente se extiende a todo el tubo.

3. Ausencia de hidrolisis de la urea: el medio conserva su color amarillo original.

Microorganismos positivos Klebsiella Proteus (rápido) Microorganismos negativos Escherichia coli Providencia

PRINCIPIO Voges-Proskauer es un epónimo doble, en honor de dos microbiólogos que trabajaron a principios del siglo xx. Estos investigadores fueron los primeros en observar la reacción de color rojo producida en medios de cultivo adecuados después del tratamiento con hidróxido de potasio. Luego se descubrió que el producto activo del medio, formado por el metabolismo bacteriano, es el acetil metil carbinol, producto de la vía del butilenglicol.

El acido pirúvico, se metaboliza da como resultado la producción de acetoina (acetil metil carbinol). Los microorganismos del grupo Klebsiella- Enterobacter-Hafnia-Serratia producen acetoina como producto metabólico final principal del metabolismo de la glucosa y forman cantidades pequeñas de ácidos mixtos. En presencia de oxigeno atmosférico e hidróxido de potasio al 40%, la acetoina se convierte a diacetilo y el a-naftol sirve de catalizador para producir un complejo de color rojo.

MEDIOS DE CULTIVO A. Caldo VP/RM Polipeptona 7g Glucosa 5 g Fosfato dipotasico 5 g Agua destilada 1 L pH final = 6,9 B. Reactivos oc-naftol al 5%. intensificador de color a-naftol 5 g Alcohol etilico absoluto 100 mL Hidroxido de potasio al 40%, agente oxidante Hidroxido de potasio 40 g Agua destilada 100 mL El medio utilizado con mayor frecuencia es el caldo de rojo de metilo- Voges-Proskauer (MR/VP) segun la formula de Clark y Lubs.

PROCEDIMIENTO Sembrar un tubo de caldo MR/VP con un cultivo puro del microorganismo por probar. Incubar 24 horas a 35 °C. Finalizada la incubación, transferir 1 ml del caldo a un tubo de ensayo limpio. Agregar 0,6 ml de a-naftol al 5%, seguidos de 0,2 ml de KOH al 40%. Es esencial que los reactivos sean agregados en ese orden. Agitar suavemente el tubo para exponer el medio al oxigeno atmosférico y dejar el tubo en reposo durante 10 a 15 minutos.

RESULTADOS Positivo: desarrollo de color rojo 15 minutos o mas después del agregado de los reactivos, que indica la presencia de diacetilo, el producto de oxidación de la acetoina. La prueba no debe leerse mas allá de una hora después de dejar los tubos en reposo, porque los cultivos Voges-Proskauer negativos pueden producir un color cobrizo, que se puede interpretar como un positivo falso.

Microorganismos positivos Klebsiella pneuminiae Yersinia enterocolítica Microorganismos negativos Escherichia coli K. ozaenae

PRINCIPIO El rojo de metilo es un indicador de pH con un rango entre 6 (amarillo) y 4,4 (rojo). El pH al cual el rojo de metilo detecta los ácidos es mucho mas bajo que el pH correspondiente a otros indicadores utilizados en medios de cultivo bacteriológicos. Por lo tanto, para provocar un cambio de color, el microorganismo en estudio debe producir grandes cantidades de acido del sustrato de hidratos de carbono que se utilice. La prueba del rojo de metilo es una prueba cuantitativa de la producción de acido, que requiere que los microorganismos positivos produzcan ácidos fuertes (lactico, acetico, formico) de la glucosa.

MEDIOS DE CULTIVO A. Caldo VP/RM Polipeptona 7g Glucosa 5 g Fosfato dipotasico 5 g Agua destilada 1 L pH final = 6,9 B. Reactivos Indicador de pH rojo de metilo. Rojo de metilo, 0,1 g en 300 ml de alcohol etílico al 95%. Agua destilada, 200 ml. El medio utilizado con mayor frecuencia es el caldo de rojo de metilo- Voges-Proskauer (MR/VP) según la formula de Clark y Lubs.

PROCEDIMIENTO 1. Sembrar el caldo MR/VP con un cultivo puro del microorganismo en estudio. Incubar el caldo a 35 °C durante 48 a 72 horas (no menos de 48 horas). 2. Finalizada la incubación, agregar 5 gotas del reactivo de rojo de metilo directamente al caldo.

RESULTADOS Positivo: El desarrollo de color rojo estable en la superficie del medio indica la suficiente producción de acido como para disminuir el pH a 4,4.

Negativo: Como otros microorganismos pueden producir pequeñas cantidades de acido del sustrato probado, puede observarse un color naranja, intermedio entre amarillo y rojo. Esto no indica una prueba positiva.

Microorganismos positivos Escherichia coli Especies de Yersinia Microorganismos negativos Enterobacter aerógenes Enterobacter cloacae Klebsiella

SIM: Sulfuro indol movilidad MIO: Movilidad indol ornitina

PRINCIPIO Es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptófano. La prueba del indol se basa en la formación de un complejo de color rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p- dimetilaminobenzaldehido. En la practica se utilizan medios combinados, como el medio de sulfuro indol para motilidad (SIM), el medio para motilidad indol omitina (MIO) o el medio indol nitrato.

SIM: SULFURO INDOL MOVILIDAD Determinar si un organismo es móvil o inmóvil, si es capaz de liberar ácido sulfhídrico por acción enzimática de los aminoácidos que contienen azufre produciendo una reacción visible de color negro y por último la capacidad de desdoblar el indol de la molécula de triptófano.

Producción de ácido sulfhídrico Producción de Indol Movilidad

PRODUCCIÓN DE ÁCIDO SULFHÍDRICO La bacteria reacciona con el tiosulfato de sodio por medio de una reacción de reducción que da un sulfito y un sulfato. El gas incoloro SH2 reacciona con una sal pesada, citrato férrico de amonio para producir un precipitado negro insoluble, sulfato ferroso.

PRODUCCIÓN DE INDOL El triptófano es un aminoácido que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolitos principales: indol, escatol e indolacético. La formación de indol se produce solamente en aquellos organismos capaces de fermentar los hidratos de carbono.

MEDIOS Y REACTIVOS Caldo triptofano (triptofano al 1%) Peptona o digerido pancreatico de caseina (tripticasa) 2 g Cloruro de sodio 0,5 g Agua destila da 100 ml Reactivo de Kovac Alcohol amilico o isoamilico puro 150 ml p-dimetilaminobenzaldehido 10 g HCI concentrado 50 ml Reactivo de Ehrlich p-dimetilaminobenzaldehido 2 g Alcohol etílico 190 ml HCI concentrado 40 ml

PROCEDIMIENTO Sembrar el caldo triptófano con el microorganismo por probar e incubar a 35 °C durante 18 a 24 horas. Una vez transcurrido este tiempo, agregar 15 gotas del reactivo haciendo que se deslicen por la pared del tubo. Si se utiliza el reactivo de Ehrlich, este paso debe ser precedido por el agregado de 1 mL de xilol. Esto no es necesario con el reactivo de Kovac.

RESULTADOS Ácido sulfhídrico: Positivo: ennegrecimiento del medio Negativo: Sin ennegrecimiento

Indol: Positivo: Anillo rojo en la superficie del medio Negativo: No se produce color /Color naranja en la superficie del medio indica desarrollo de escatol, un compuesto metilado que puede ser precursor de la formación de indol. La reacción positiva después de 24 horas indica una prueba completa. Si el cultivo de 24 hrs es negativo deberá incubarse otras 24 horas y repetirse la prueba.

Movilidad Positiva: los organismos móviles migran de la línea de siembra y se difunden en el medio provocando turbiedad. Negativa: Crecimiento bacteriano acentuado siguiendo la línea de siembra.

BacteriasProducción H 2 SProducción IndolMovilidad Salmonella typhi+/--+ Salmonella+/--+ E. coli-++/- Klebsiella-+/-- Enterobacter--+ Citrobacter+-+ Shigella-+/-

MIO: MOVILIDAD, INDOL, ORNITINA Composición del medio: Extracto de levadura Peptona L-Ornitina Dextrosa Agar Agua Indicador de pH: púrpura de bromocresol Ácido: amarillo pH 5.2 Alcalino: Púrpura pH 6.8 Medio no inoculado: Púrpura intenso brillante pH 6.0

PRINCIPIO El MIO se utiliza para la identificación de enterobacterias sobre la base de movilidad, la producción de ornitina descarboxilasa e indol. 1.Descarboxilación de ornitina 2.Producción de indol 3.Movilidad

Descarboxilación de ornitina: mide la capacidad enzimática de un organismo para descarboxilar un aminoácido para formar una amina, con la consiguiente alcalinidad.

Producción de indol: El triptófano es un aminoácido que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolitos principales: indol, escatol e indolacético.

PROCEDIMIENTO Inoculación: picadura en forma vertical Tiempo: hrs Temperatura °C

RESULTADOS Ornitina descarboxilasa Positivo: color púrpura del medio Negativo: color amarillo en el fondo del tubo que puede ser púrpura al final Indol: Positivo: anillo rojo en la superficie del medio Negativa: No se Produce color / Color naranja en la superficie del medio, indica desarrollo de escatol

Movilidad: Positiva: los organismos móviles migran de la línea de siembra y se difunden en el medio provocando turbiedad. Negativa: crecimiento bacteriano acentuado siguiendo la línea de siembra.

Microorganismos ornitina positivos Especies de Enterobacter Proteus mirabilis Proteus morganii Yersinia enterocolitica Microorganismos ornitina negativos Especies de Klebsiella Enterobacter aglomerans Proteus vulgaris Proteus rettgeri Yersinia pestis Yersinia pseudotuberculosis

BacteriasProducción IndolMovilidadProducción H 2 S Salmonella typhi-++/- Otras Salmonellas-++/- E. coli++/-- Klebsiella+/--- Enterobacter-+- Citrobacter-++ Shigella+/- -

MEDIO DE CULTIVO Agar hierro de klinger (AHK) Composición: Estracto de carne Extracto de levadura Peptona Proteasa Lactosa Dextrosa Sulfato ferroso Cloruro de Na Tiosulfato de Na Agar Agua destilada Indicador: Rojo fenol Ácido: amarillo Alcalino: Rojo Medio no inoculado: naranja rojizo, pH 7.4

PRINCIPIO Determina la capacidad de un organismo de atacar un hidrato de carbono específico incorporado en un medio de crecimiento básico, con producción o no de gases, junto con la determinación de posible ácido sulfhídrico.

La fermentación es un proceso que se lleva a cabo en condiciones aeróbicas (pico de flauta) y anaeróbicamente (capa inferior) El medio TSI contiene una cantidad limitante de glucosa y concentración 10 veces mayor de lactosa. Las enterobacterias y los fermentadores de glucosa comienzan metabolizando este azúcar. Una vez que se ha reducido toda la glucosa piruvato, este se metaboliza por el ciclo de Krebs formando productos finales ácidos.

El ácido en el medio hace virar el amarillo del indicador de pH, rojo fenol. A 6 horas de la incubación, la zona de la estría y el fondo del tubo tendrán un color amarillo (fermentador de glucosa)

Si el fondo permanece rojo, no hay variación de pH (no fermentador de glucosa) Si el color rojo es mas intenso que el original, hay alcalinización (no es miembro de la familia enterobacteriaceae)

Al agotar la glucosa la bacteria utiliza la lactosa o sacarosa. Después de hrs, el medio permanece amarillo, reacción ácido sobre ácido (A/A). Fermentador de lactosa. La producción de gas romperá el agar o lo empujara hacia arriba. Reacción A/A más gas.

Si no utiliza la lactosa, hará uso de proteínas o aminoácidos. El metabolismo proteico se produce en la superficie de la zona inclinada donde el oxígeno es abundante hrs de incubación: zona inclinada roja fondo del agar amarillo (metabolismo anaerobio de glucosa inicial). Reacción alcalina sobre ácido K/A.

Las bacterias que fermentan glucosa también pueden formar productos alcalinos a partir de la utilización de la peptona, sobre la zona inclinada. Reacción K/K.

PROCEDIMIENTO Inoculación: picadura y estría en pico de flauta. Tiempo: hrs Temperatura:35-37°C

RESULTADOS K/A: fermentación de glucosa solamente (Pico de flauta alcalino/profundidad ácida). Característico de bacterias no fermentadores de lactosa como Shigella. A/A: fermentación de glucosa y lactosa (Pico de flauta ácido/ profundidad ácida). Característicos de E. coli y grupo Klebsiella-Enterobacter. K/K: No fermentación de glucosa y lactosa (pico de flauta alcalino/profundidad alcalina). Característico de bacterias no fermentadoras como Pseudomas aeruginosa

Especie bacterianaSuperficieFondoGasH2SH2S EnterobacterAK++- KlebsiellaAA++- E. ColiAA+- ShigellaKA-- Salmonella typhiKA-+ Salmonella paratyphiKA+- CitrobacterKA++++ Proteus vulgarisKA++++ ProvidenciaKA+/--

COLOR: LILA INDICADOR: PÚRPURA DE BROMOCRESOL SUSATRATPOS PRINCIPALES: LISINA Y HLUCOSA

MEDIO DE CULTIVO Base de descarboxilasa de Moller Composición: Peptona Extracto de carne Piridoxal L-lisina Citrato de amonio Tiosulfato de sodio Glucosa Agua destilada Agar Indicador de pH: Purpura de bromocresol Ácido: Amarillo pH 5.2 Alcalino: Púrpura pH 6.8 Medio no inoculado: Purpura intenso brillante pH 6.0

PRINCIPIO Mide la capacidad enzimática de un organismo para descarboxilar un aminoácido (lisina y arginina) para formar una amina con la consiguiente alcalinidad.

PROCEDIMIENTO Inoculación: por picadura y estría, inóculo liviano. Temperatura: 35-37°C Tiempo hrs

RESULTADOS A: ácido K: alcalino N: neutra R: Rojo (desaminación oxidativa)

K/K: Azul de Prusia/azul de Prusia. Desaminación oxidativa/descarboxilación. K/A: azul de Prusia/lila. No desaminación. Producción de H 2 S: Enegrecimiento del medio Producción de gas: burbujas o levantamiento del medio de cultivo de las paraedes del tubo.

Especie BacterianaSuperficieFondoGasH2SH2S E. ColiKK/N+/-- ShigellaKA-- Salmonella typhiKK-+/- S. paratyphiKK+/--/+ Enterobacter clocaeKA+/--

El agar sangre es una combinación de un agar base (agar nutritivo) con fuente proteica (digeridos trípticos, digeridos proteicos de soja) el cual tiene un agregado de 5 % de sangre ovina, (también puede usarse sangre humana, para cultivos en una placa de Agar) con una pequeña cantidad de hidratos de carbono naturales y cloruro sódico.

Se usa para ver la capacidad hemolítica de los microorganismos patógenos (que es un factor de virulencia). Observando los halos hemolíticos alrededor de las colonias se determina el tipo de hemólisis que posee: Alfa: halos verdosos Beta: halos incoloros Gamma: inexistencia de halos.