ESCUELA SUPERIOR POLITECNICA DEL LITORAL Facultad de Ingeniería Mecánica y Ciencias de la Producción Tesis de Grado Previo a la obtención del título de INGENIERO AGROPECUARIO Presentado por: Omar Oswaldo Olvera Vaca Director: Rodolfo Maribona H. Guayaquil - Ecuador 2003

“INFLUENCIA DE FACTORES ABIÓTICOS SOBRE LA EXPRESIÓN DEL VIRUS DEL RAYADO DEL BANANO (BSV) EN PLANTAS DE BANANO”

ANTECEDENTES En 1998, la superficie afectada por el “Fenómeno del Niño” fue de 24.803 ha que afectó a la economía agrícola ecuatoriana. El estrés ocasionado por la saturación hídrica de los suelos y los cambios de temperatura provocaron el incremento de síntomas del BSV. Oficialmente la intensidad de esta epifítia no ha sido monitoreada. En la actualidad, la presencia del BSV ha comenzado extendiéndose a lugares tales como: Patricia Pilar, Quevedo, Empalme, Valencia, La Maná, Vinces, Milagro, El Triunfo y Bucay.

ANTECEDENTES - EL BSV frecuentemente se confunde en las primeras etapas con la infección del Virus del Mosaico del Pepino (CMV), deficiencia de P. y variación somaclonal. -El efecto del cultivo de tejidos de meristema no logra un saneamiento del BSV debido a que se integra al genoma de la célula de la planta (AAB).

HIPÓTESIS EXISTE INFLUENCIA DE FACTORES ABIÓTICOS QUE CAUSAN LA EXPRESIÓN DEL BSV.

OBJETIVO GENERAL - Establecer los síntomas típicos ocasionados por el Virus del Rayado del Banano (BSV) y su efecto sobre el vigor en plantas de banano en distintas etapas de desarrollo sometidas a estrés abiótico. OBJETIVOS ESPECÍFICOS - Establecer el diagnóstico diferencial visual en plantas adultas de banano. - Estudiar los efecto del estrés térmico, hídrico y la influencia hormonal en la expresión de los síntomas del BSV y vigor en plantas juveniles cultivadas in vitro. - Detectar precozmente los síntomas del BSV en plantas procedentes de cultivo de tejido. - Confirmar la sintomatología mediante la comprobación de la presencia del BSV en las hojas de Banano por Microscopía electrónica.

DESCRIPCIÓN DEL VIRUS DEL RAYADO DEL BANANO (BSV) Reichel, H., Belalcazar, S. Bell Lockhart ESPOL 2000

INFECCION VIRAL DEL BSV EN UNA CELULA VEGETAL

SINTOMAS POR DIFICIENCIAS DE FOSFORO Y ZINC Fig. a) Deficiencia de fósforo INPOFOS 1995 Fig. b) Deficiencia de Zinc INPOFOS 1995

SINTOMAS POR TOXICIDAD Y CMV Fig. d) sintomas del Virus del Mosaico del Pepino (CMV) (Dr H.J. Su, National Taiwan University, Taipei) Fig. c) Toxicidad por herbicida INPOFOS 1995

MATERIALES Etapa1. Identificación de los síntomas y Purificación del BSV. Muestras foliares del clon Valery Tubos de ensayo, pipetas, papel filtro, licuadora, balanza, peachimetro(Modelo 15) Centrifuga (Hitachi SCR 208,Rotor RPR9-260,RPM =8500). Ultracentrifuga (Hitachi SSP-72,Rotor,RP65T-627,RPM=65000) Triton x-100,Mercaptoetanol,Tris, Polivinilpirrolidona

Etapa 2.Propagación in vitro 30 hijuelos (Valery) Herramientas de limpieza Equipos de laboratorio Medio normal de Murashige y Skoog Reactivos: polietilen glicol(PEG),6-bencilaminopurina(BAP) y temperatura Equipo de computación Literatura consultada

MÉTODO Etapa 1 Identificación de los síntomas de BSV en plantas adultas de banano, en la Agrícola Martinica provincia de Los Ríos. El diagnóstico visual fue confirmado por inmunoensayo (Lockhart B.) y se comprobó por microscopía electrónica la presencia de la partícula viral. Se utilizó el protocolo del Dr. Lockhart 1986, se realizó ciertas modificaciones (Instituto Higiene Izquieta Pérez Guayaquil).

MÉTODO Etapa 2 Se recolectó hijuelos de plantas madres enfermas y sanas que estaban diagnosticadas. Estos hijuelos fueron micropropagados en el laboratorio de SEBIOCA-ESPOL. Las plántulas asintomáticas, obtenidas por micropropagación, cultivadas in vitro en condiciones de estrés por frío, estrés hídrico y hormonal.

Etapa 1: Recolección del material en el campo. Identificación de las plantas adultas de banano del clon Valery con los síntomas foliares causados por el BSV. Rayado amarillo en hojas inferiores Plantas adultas de banano

OBTENCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL VIRUS PARA EL DIAGNÓSTICO.

Etapa 2. Propagación in vitro de plantas sanas e infectadas Explantación Introducción Propagación Plántulas en invernadero

ESQUEMA DEL PRECESO DE LOS TRATAMIENTOS IN VITRO

Tratamientos correspondientes a la investigación Medios de cultivos T E M P E R A T U R A 7 18º C 26º C 18° C a 34º C Enfermas Sanas 1. m1=PEG 1 (3%) 20 2. m2=PEG 2 (6%) 3. m3=PEG 3 (9%) 4. m4=Sin BAP en el medio 5. m5=5 veces menor /dosis 6. m6=Testigo /dosis normal 7. m7=5 veces mayor /dosis T O T A L P L A N T A S 840

Variable evaluadas Los parámetros de crecimiento que se evaluaron en los periodos de estrés, enraizamiento y adaptación fueron: Área foliar (ancho por largo cm2) Altura desde la base del pseudo tallo hasta la ¨ V ¨ foliar en cm. Peso de todas las plantas de cada tratamiento en gramos Se valora en cruces (X hasta 4X) el crecimiento radical de cada tratamiento. Los valores son los siguientes: X 0-1 raíz 2X 2-3 raíces 3X 4-5 raíces 4X 6-7 raíces

ANÁLISIS ESTADÍSTICO Se utilizó un diseño completamente al azar con un arreglo factorial, 7 (medios de cultivos) x 2 (presencia – ausencia del virus) x 3 (tipo de temperaturas de 18º C, 26º C y 18º C a 32º C) Factores en estudio: Medio de crecimiento Tipo de planta Temperatura de crecimiento Interacciones presentes: Medios de cultivo por tipo de planta Medios de cultivos por temperatura de crecimiento Tipo de planta por temperatura de crecimiento Medio de cultivo por tipo de planta por temperatura de crecimiento

RESULTADOS Descripción de las plantas adultas con síntomas. Los síntomas diferenciales de plantas adultas enfermas en el campo fueron el rayado amarillo que se torna en café oscuro y la presencia de lesiones necróticas en las nervaduras de las hojas inferiores y moteado clorótico. Estos síntomas fueron confirmados por inmunoensayo y microscopia electrónica Fig. a) Un rayado amarillo . Fig. b) Un rayado café oscuro Fig. c)Lesiones necróticas

Síntomas atípicos del Virus del Rayado del Banano (BSV) Fig. a) Los síntomas empiezan desde el borde de la hoja Fig. b) Síntomas locales en las hojas inferiores Fig. c) Síntomas del moteado clorótico

Evaluación de síntomas en hijuelos Los hijuelos no presentaron ningún rayado amarillo en las hojas antes de la introducción in vitro (Fig. a) Fig. a) hijuelos asintomáticos

ÁREA FOLIAR EN LOS DIFERENTES TRATAMIENTOS IN VITRO **: ALTAMENTE SIGNIFICATIVA ** m4i2t2 , m4i1t1 , m6i1t1 (interacción) ; ns periodo de enraizamiento y adaptación ** 18° C , 26° C

ALTURA DE LAS PLANTULAS ** m4i1t1 ; m4i1t2 ; m6i1t1 ; m4i2t1 (interacción) -ns en el periodo de enraizamiento y adaptación ns 18° C a 34° C valores bajo de crecimiento.

PESO DE LAS PLANTULAS ** m4, m5, m6 (medios) ns m2, m3, (Peg 6% y 9%)

CRECIMIENTO RADICULAR EN EL PERIODO DE ESTRES m4,(19-24); m5,(25-30) mayor crecimiento radicular. m7,(37-42) menor crecimiento radicular, m3,(13-18 Peg 9%)

Vitroplantas con síntomas precoz causado por el virus Plántulas con síntomas precoces de BSV en cultivo in vitro en combinación con estrés de frío e hídrico Fig. a) Plántulas con PEG al 3% a 18º C Fig. b) Testigo.

Plántulas con síntomas por BSV en el periodo de invernadero Fig. a) un rayado amarillo en las hojas Fig. b) testigo.

Plantas de variación somaclonal Fig. a) tipo variegado

Aislamiento, purificación y caracterización del virus mediante la tinción negativa al 1% de ácido Fosfotúngstico, de fracciones virales purificadas por CsCl, fueron observadas al microscopio electrónico Partículas virales baciliformes del virus del rayado del banano (BSV).

CONCLUSIONES Los síntomas diferenciales de plantas adultas enfermas en el campo fueron el rayado amarillo que se torna en café oscuro y la presencia de lesiones necróticas en las nervaduras de las hojas inferiores y un moteado clorótico en el área foliar. Esto síntomas permiten diferenciar el BSV de otras enfermedades. Existió un crecimiento vegetativo heterogéneo de las plantas sanas y enfermas en el periodo de estrés de los tratamientos in vitro de 18° C y 26° C. La presencia de concentraciones mayores de PEG de 6% y 9% disminuye el crecimiento vegetativo in vitro. En el periodo de enraizamiento y adaptación se recuperaron significativamente.

Las plántulas enfermas en condiciones de cultivo in vitro presentaron síntomas de la enfermedad en un 20 %, cuando fueron sometidas al estrés combinado de frío y estrés hídrico. Estos síntomas aumentaron a un 50 %, cuando las plántulas fueron transplantadas y cultivadas en el invernadero, se observó que los síntomas resultaron semejantes a las que se presentan en plantas adultas enfermas con el BSV presencia de un rayado amarillo en las hojas. Por primera vez en el Ecuador se logró el aislamiento, purificación por ultracentrifugación en CsCl y caracterización por microscopia electrónica de un virus de planta realizado mediante modificaciones exitosas del protocolo descrito por Lockhart, 1986.

RECOMENDACIONES Difundir en la práctica agrícola bananera los síntomas descritos en este trabajo que permiten diferenciar el BSV de otras enfermedades. Introducir en la práctica de la micropropagación comercial de banano el diagnóstico precoz establecido para plántulas en la fase de endurecimiento en invernadero. Descifrar los mecanismos moleculares que inducen la aparición de los síntomas de la enfermedad del BSV cuando las plántulas son sometidas al estrés combinado de frío e hídrico.

Basado en el diagnóstico diferencial visual establecido para plantas adultas, monitorear la presencia de la enfermedad y erradicar las plantas enfermas.

AGRADECIMIENTO A: Dra. Sofia Korneva Dr. Anselmo Otero Dr. Amano Gasupi Dr. Miguel Ramos Dr. Sabino Hernández Sr. Cyndrich Miljenko Ing. Bernardo Manzano Biol. José Flores Biol. Miguel Gutiérrez Sr. Jorge Villavicencio MSc. Florence Malafose (INIBAP). Dejo constancia de mi profundo aprecio por creer en la juventud que sí podemos hacer investigaciones aplicadas para resolver problemas nacionales como es el Virus del Rayado del Banano (BSV), al Dr. Rodolfo Maribona, Director de mí Tesis, por su ayuda invaluable.